Πρωτεϊνάση K mNGS (υγρό)
Η πρωτεϊνάση Κ είναι μια σταθερή πρωτεάση σερίνης με ευρεία εξειδίκευση υποστρώματος.Αποδομεί πολλές πρωτεΐνες στη φυσική τους κατάσταση ακόμη και παρουσία απορρυπαντικών.Στοιχεία από μελέτες κρυσταλλικής και μοριακής δομής δείχνουν ότι το ένζυμο ανήκει στην οικογένεια σουμπτιλισίνης με μια καταλυτική τριάδα ενεργού κέντρου (Asp39-Του69-Σερ224).Η κυρίαρχη θέση διάσπασης είναι ο πεπτιδικός δεσμός δίπλα στην καρβοξυλομάδα των αλειφατικών και αρωματικών αμινοξέων με αποκλεισμένες άλφα αμινομάδες.Χρησιμοποιείται συνήθως για την ευρεία ιδιαιτερότητά του.Αυτή η πρωτεϊνάση Κ είναι ειδικά σχεδιασμένη για mNGS.Σε σύγκριση με την άλλη πρωτεϊνάση Κ, περιέχει ακόμη λιγότερη μόλυνση νουκλεϊκού οξέος με την ίδια ενζυματική απόδοση, η οποία θα μπορούσε να εξασφαλίσει καλύτερα την κατάντη εφαρμογή mNGS.
Συνθήκες αποθήκευσης
2-8℃ για 2 χρόνια
Προσδιορισμός
| Εμφάνιση | Άχρωμο έως ανοιχτό καφέ υγρό |
| Δραστηριότητα | ≥800 U/ml |
| Συγκέντρωση πρωτεΐνης | ≥20 mg/ml |
| Nickase | Δεν εντοπίστηκε κανένα |
| DNase | Δεν εντοπίστηκε κανένα |
| RNase | Δεν εντοπίστηκε κανένα |
Ιδιότητες
| Αριθμός ΕΚ | 3.4.21.64(Ανασυνδυασμός από το άλμπουμ Tritirachium) |
| Ισοηλεκτρικό σημείο | 7.81 |
| Βέλτιστο pH | 7,0- 12,0 Εικ. 1 |
| Βέλτιστη θερμοκρασία | 65 ℃ Εικ. 2 |
| σταθερότητα pH | pH 4,5- 12,5 (25 ℃, 16 h) Εικ. 3 |
| Θερμική σταθερότητα | Κάτω από 50 ℃ (pH 8,0, 30 λεπτά) Εικ. 4 |
| Σταθερότητα αποθήκευσης | Πάνω από 90% δραστηριότητα για 12 μήνες στους 25 ℃ |
| Ενεργοποιητές | SDS, ουρία |
| Αναστολείς | Φθοριοφωσφορικό διισοπροπύλιο;φαινυλομεθυλσουλφονυλοφθορίδιο |
Εφαρμογές
1. Κιτ γενετικής διάγνωσης
2. Κιτ εξαγωγής RNA και DNA
3. Εκχύλιση μη πρωτεϊνικών συστατικών από ιστούς, αποικοδόμηση πρωτεϊνικών ακαθαρσιών, όπως το DNAεμβόλια και παρασκευή ηπαρίνης
4. Παρασκευή DNA χρωμοσώματος με παλμική ηλεκτροφόρηση
5. Western blot
6. Ενζυματικά αντιδραστήρια γλυκοζυλιωμένης λευκωματίνης in vitro διάγνωση
Προφυλάξεις
Φοράτε προστατευτικά γάντια και γυαλιά όταν χρησιμοποιείτε ή ζυγίζετε και διατηρείτε τον καλό αερισμό μετά τη χρήση.Αυτό το προϊόν μπορεί να προκαλέσει δερματική αλλεργική αντίδραση και σοβαρό οφθαλμικό ερεθισμό.Εάν εισπνευστεί, μπορεί να προκαλέσει αλλεργία ή συμπτώματα άσθματος ή δύσπνοια.Μπορεί να προκαλέσει ερεθισμό του αναπνευστικού συστήματος.
Ορισμός μονάδας
Μία μονάδα (U) ορίζεται ως η ποσότητα του ενζύμου που απαιτείται για την υδρόλυση της καζεΐνης για την παραγωγή 1 μmolτυροσίνη ανά λεπτό υπό τις ακόλουθες συνθήκες.
Προετοιμασία αντιδραστηρίων
Αντιδραστήριο Ι: 1 g καζεΐνης γάλακτος διαλύθηκε σε 50 ml διαλύματος φωσφορικού νατρίου 0,1 Μ (ρΗ 8,0), επωάστηκε σε 65-70 ℃ νερό για 15 λεπτά, αναδεύτηκε και διαλύθηκε, ψύχθηκε με νερό, ρυθμίστηκε με υδροξείδιο νατρίου σε ρΗ 8,0 και σταθεροποιήθηκε ο όγκος 100 ml.
Αντιδραστήριο II: 0,1Μ τριχλωροξικό οξύ, 0,2Μ οξικό νάτριο, 0,3Μ οξικό οξύ.
Αντιδραστήριο III: 0,4Μ Na2CO3λύση.
Αντιδραστήριο IV: Αντιδραστήριο Forint αραιωμένο με καθαρό νερό για 5 φορές.
Αντιδραστήριο V: Αραιωτικό ενζύμου: 0,1 Μ διάλυμα φωσφορικού νατρίου (pH 8,0).
Αντιδραστήριο VI: διάλυμα τυροσίνης: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml τυροσίνης διαλυμένη με 0,2Μ HCl.
Διαδικασία
1. 0,5 ml αντιδραστηρίου Ι προθερμαίνεται στους 37 ℃, προσθέτουμε 0,5 ml διαλύματος ενζύμου, ανακατεύουμε καλά και επωάζουμε σε37℃ για 10 λεπτά.
2. Προσθέστε 1 ml αντιδραστηρίου II για να σταματήσετε την αντίδραση, ανακατέψτε καλά και συνεχίστε την επώαση για 30 λεπτά.
3. Φυγοκεντρήστε το διάλυμα αντίδρασης.
4. Πάρτε 0,5 ml υπερκείμενου, προσθέστε 2,5 ml αντιδραστήριο III, 0,5 ml αντιδραστήριο IV, ανακατέψτε καλά και επωάστε στους 37℃για 30 λεπτά.
5. ΟΔ660προσδιορίστηκε ως OD1;τυφλή ομάδα ελέγχου: 0,5 ml αντιδραστηρίου V χρησιμοποιείται για την αντικατάσταση του ενζύμουλύση για τον προσδιορισμό της OD660ως ΟΔ2, ΔOD=OD1-ΟΔ2.
6. Πρότυπη καμπύλη L-τυροσίνης: 0,5 mL διαφορετικής συγκέντρωσης διάλυμα L-τυροσίνης, 2,5 mL αντιδραστηρίου III, 0,5 mL αντιδραστηρίου IV σε σωλήνα φυγοκέντρησης 5 mL, επώαση σε 37℃ για 30 λεπτά, ανίχνευση OD660για διαφορετική συγκέντρωση L-τυροσίνης, στη συνέχεια λήφθηκε η τυπική καμπύλη Y=kX+b, όπου Υ είναι η συγκέντρωση L-τυροσίνης, X είναι OD600.
Υπολογισμός
2: Συνολικός όγκος διαλύματος αντίδρασης (mL)
0,5: Όγκος ενζυμικού διαλύματος (mL)
0,5: Όγκος υγρού αντίδρασης που χρησιμοποιείται στον χρωμογόνο προσδιορισμό (mL)
10: Χρόνος αντίδρασης (λεπτά)
Df: Αραιώσεις πολλαπλές
C: Συγκέντρωση ενζύμου (mg/mL)
βιβλιογραφικές αναφορές
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz Η. Biochem.Biophys.Res.Commun.(1971);44:513.
3. Hilz, H.et al.,Ευρώ.J. Biochem.(1975);56:103-108.
4. Sambrook Jet αλ., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).
Φιγούρες
Σύκο.1 Βέλτιστος pH
100 mM ρυθμιστικό διάλυμα: pH6,0-8,0, φωσφορικό Na;pH8,0-9,0, Tris-HCl;pH9,0-12,5, Glycine-NaOH.Συγκέντρωση ενζύμου:1mg/mL
Εικ.2 Βέλτιστη θερμοκρασία
Αντίδραση σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού Κ 20 mM ρΗ 8,0.Συγκέντρωση ενζύμου: 1 mg/mL
Εικ.3 pH Σταθερότητα
25 ℃, 16 h-επεξεργασία με ρυθμιστικό διάλυμα 50 mM: pH 4,5- 5,5, οξικό;ρΗ 6,0-8,0, φωσφορικό νάτριο;pH 8,0-9,0, Tris-HCl.ρΗ 9,0-12,5, Γλυκίνη-ΝαΟΗ.Συγκέντρωση ενζύμου: 1 mg/mL
Εικ.4 Θερμική σταθερότητα
Επεξεργασία 30 λεπτών με ρυθμιστικό διάλυμα Tris-HCl 50 mM, ρΗ 8,0.Συγκέντρωση ενζύμου: 1 mg/mL
Εικ.5 Αποθήκευση σταθερόty at 25℃
