Πρωτεϊνάση Κ (Λυοφιλοποιημένη σκόνη)
Αριθμός γάτας: HC4500A
Η πρωτεϊνάση Κ είναι μια σταθερή πρωτεάση σερίνης με ευρεία εξειδίκευση υποστρώματος.Αποδομεί πολλές πρωτεΐνες στη φυσική τους κατάσταση ακόμη και παρουσία απορρυπαντικών.Στοιχεία από μελέτες κρυσταλλικής και μοριακής δομής δείχνουν ότι το ένζυμο ανήκει στην οικογένεια σουμπτιλισίνης με μια καταλυτική τριάδα ενεργού κέντρου (Asp39-Του69- Σερ224).Η κυρίαρχη θέση διάσπασης είναι ο πεπτιδικός δεσμός δίπλα στην καρβοξυλομάδα των αλειφατικών και αρωματικών αμινοξέων με αποκλεισμένες άλφα αμινομάδες.Χρησιμοποιείται συνήθως για το ευρύ τουειδικότητα.
Συνθήκες αποθήκευσης
2-8℃ βραχυπρόθεσμη αποθήκευση, -25~-15℃ μακροχρόνια αποθήκευση.Κατάσταση ξηρής σκόνης -25~-15℃ ισχύει για 3 χρόνια.η σκόνη του ενζύμου θα πρέπει να διαλυθεί στον κατάλληλο όγκο.
Προσδιορισμός
| Εμφάνιση | Λευκή έως υπόλευκη άμορφη λυοφιλοποιημένη σκόνη |
| Δραστηριότητα | ≥30 U/mg |
| DNase | Δεν εντοπίστηκε κανένα |
| RNase | Δεν εντοπίστηκε κανένα |
Ιδιότητες
| Αριθμός ΕΚ | 3.4.21.64 (Ανασυνδυασμός από το άλμπουμ Tritirachium) |
| Μοριακό βάρος | 29 kDa (SDS-PAGE) |
| Ισοηλεκτρικό σημείο | 7.81 |
| Βέλτιστο pH | 7.0-12.0 Εικ.1 |
| Βέλτιστη θερμοκρασία | 65 ℃ Εικ.2 |
| σταθερότητα pH | pH 4,5-12,5 (25℃, 16h) Εικ.3 |
| Θερμική σταθερότητα | Κάτω από 50℃ (pH 8,0, 30 λεπτά) Εικ.4 |
| Ενεργοποιητές | SDS, ουρία |
| Αναστολείς | Φθοριοφωσφορικό διισοπροπύλιο;φαινυλομεθυλσουλφονυλοφθορίδιο |
Εφαρμογές
1. Κιτ γενετικής διάγνωσης
2. Κιτ εξαγωγής RNA και DNA
3. Εκχύλιση μη πρωτεϊνικών συστατικών από ιστούς, αποικοδόμηση πρωτεϊνικών ακαθαρσιών, όπως εμβόλια DNA και παρασκευή ηπαρίνης
4. Παρασκευή DNA χρωμοσώματος με παλμική ηλεκτροφόρηση
5. Western blot
6. Ενζυματικά αντιδραστήρια γλυκοζυλιωμένης αλβουμίνης in vitro διάγνωση
Προφυλάξεις
Φοράτε προστατευτικά γάντια και γυαλιά όταν χρησιμοποιείτε ή ζυγίζετε και διατηρείτε τον καλό αερισμό μετά τη χρήση.Αυτό το προϊόν μπορεί να προκαλέσει δερματική αλλεργική αντίδραση και σοβαρό οφθαλμικό ερεθισμό.Εάν εισπνευστεί, μπορεί να προκαλέσει αλλεργία ή συμπτώματα άσθματος ή δύσπνοια.Μπορεί να προκαλέσει ερεθισμό του αναπνευστικού συστήματος.
Χημική δοκιμή
Ορισμός μονάδας
Μία μονάδα (U) ορίζεται ως η ποσότητα του ενζύμου που απαιτείται για την υδρόλυση της καζεΐνης για την παραγωγή 1 μmol τυροσίνης ανά λεπτό υπό τις ακόλουθες συνθήκες.
Προετοιμασία αντιδραστηρίων
Αντιδραστήριο Ι: 1 g καζεΐνης γάλακτος διαλύθηκε σε 50 ml διαλύματος φωσφορικού νατρίου 0,1 Μ (ρΗ 8,0), επωάστηκε σε 65-70 ℃ νερό για 15 λεπτά, αναδεύτηκε και διαλύθηκε, ψύχθηκε με νερό, ρυθμίστηκε με υδροξείδιο νατρίου σε ρΗ 8,0 και σταθεροποιήθηκε ο όγκος 100 ml.
Αντιδραστήριο II: 0,1Μ τριχλωροξικό οξύ, 0,2Μ οξικό νάτριο, 0,3Μ οξικό οξύ.
Αντιδραστήριο III: 0,4Μ Na2CO3λύση.
Αντιδραστήριο IV: Αντιδραστήριο Forint αραιωμένο με καθαρό νερό για 5 φορές.
Αντιδραστήριο V: αραιωτικό ενζύμου: 0,1 Μ διάλυμα φωσφορικού νατρίου (ρΗ 8,0).
Αντιδραστήριο VI: διάλυμα τυροσίνης: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml τυροσίνης διαλυμένη με 0,2 Μ HCL.
Διαδικασία
1. 0,5 ml αντιδραστηρίου Ι προθερμαίνεται στους 37 ℃, προσθέτουμε 0,5 ml διαλύματος ενζύμου, ανακατεύουμε καλά και επωάζουμε στους 37℃ για 10 λεπτά.
2. Προσθέστε 1 ml αντιδραστηρίου II για να σταματήσετε την αντίδραση, ανακατέψτε καλά και συνεχίστε την επώαση για 30 λεπτά.
3. Φυγοκεντρήστε το διάλυμα αντίδρασης.
4. Πάρτε 0,5 ml υπερκειμένου, προσθέστε 2,5 ml αντιδραστηρίου III, 0,5 ml αντιδραστηρίου IV, ανακατέψτε καλά και επωάστε στους 37℃ για 30 λεπτά.
5. ΟΔ660προσδιορίστηκε ως OD1;τυφλή ομάδα ελέγχου: 0,5 ml αντιδραστηρίου V χρησιμοποιείται για την αντικατάσταση του ενζυμικού διαλύματος για τον προσδιορισμό της OD660ως ΟΔ2, ΔOD=OD1-ΟΔ2.
6. Πρότυπη καμπύλη L-τυροσίνης: 0,5 mL διαφορετικής συγκέντρωσης διάλυμα τυροσίνης L, 2,5 mL αντιδραστηρίου III, 0,5 mL αντιδραστηρίου IV σε σωλήνα φυγοκέντρησης 5 mL, επώαση σε 37℃ για 30 λεπτά, ανίχνευση OD660για διαφορετική συγκέντρωση L-τυροσίνης, στη συνέχεια λήφθηκε η τυπική καμπύλη Y=kX+b, όπου Υ είναι η συγκέντρωση L-τυροσίνης, X είναι OD600.
Υπολογισμός
2: Συνολικός όγκος διαλύματος αντίδρασης (mL)
0,5: Όγκος ενζυμικού διαλύματος (mL)
0,5: Όγκος υγρού αντίδρασης που χρησιμοποιείται στον χρωμογόνο προσδιορισμό (mL)
10: Χρόνος αντίδρασης (λεπτά)
Df: Αραιώσεις πολλαπλές
C: Συγκέντρωση ενζύμου (mg/mL)
βιβλιογραφικές αναφορές
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972), 23:77.
2. Wieger U & Hilz Η. Biochem.Biophys.Res.Commun.(1971), 44:513.
3. Hilz, H.et al.,Ευρώ.J. Biochem.(1975), 56:103-108.
4. Sambrook Jet αλ., Molecular Cloning: Α Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).
Εικ. 2 Βέλτιστη θερμοκρασία
Αντίδραση σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού Κ 20 mM ρΗ 8,0.Συγκέντρωση ενζύμου: 1 mg/mL
Εικ. 3 pH Σταθερότητα
25℃, 16 h-επεξεργασία με ρυθμιστικό διάλυμα 50 mM: pH 4,5-5,5, οξικό;ρΗ 6,0-8,0, φωσφορικό νάτριο;pH 8,0-9,0, Tris-HCL.ρΗ 9,0-12,5, Γλυκίνη-ΝαΟΗ.Συγκέντρωση ενζύμου: 1 mg/mL
Εικ. 4 Θερμική σταθερότητα
Επεξεργασία 30 λεπτών με ρυθμιστικό διάλυμα Tris-HCL 50 mM, ρΗ 8,0.Συγκέντρωση ενζύμου: 1 mg/mL
Εικ. 5 Αποθήκευση σταθερόty at 25℃
