Αντίστροφη μεταγραφάση RTL
Η ανάστροφη μεταγραφάση RTL είναι μια πολυμεράση DNA που εξαρτάται από το πρότυπο RNA που στερείται δραστηριότητας εξωνουκλεάσης 3'→5' και έχει δραστηριότητα RNase H.Αυτό το ένζυμο μπορεί να χρησιμοποιήσει το RNA ως πρότυπο για τη σύνθεση ενός συμπληρωματικού κλώνου DNA, το οποίο μπορεί να εφαρμοστεί στη σύνθεση cDNA πρώτου κλώνου, ειδικά για RT-LAMP (ισόθερμη ενίσχυση με μεσολάβηση βρόχου).Σε σύγκριση με την αντίστροφη μεταγραφάση RTL 1.0, η ευαισθησία είναι σημαντικά βελτιωμένη, η θερμική σταθερότητα είναι ισχυρότερη και η αντίδραση στους 65°C είναι πιο σταθερή.Η ανάστροφη μεταγραφάση RTL (χωρίς γλυκερόλη) μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την παρασκευή λυοφιλοποιημένων παρασκευασμάτων, λυοφιλοποιημένων αντιδραστηρίων RT-LAMP κ.λπ.
Ορισμός μονάδας
Μία μονάδα ενσωματώνει 1 nmol dTTP σε υλικό που κατακρημνίζεται με οξύ σε 20 λεπτά στους 50°C χρησιμοποιώντας πολυ(Α)•ολιγο(dT)25 ως εκκινητήριο πρότυπο.
Συστατικά
| Συστατικό | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| Αντίστροφη μεταγραφάση RTL (χωρίς γλυκερόλη) (15 U/μL) | 0,1 mL | 1 mL | 10 mL |
| Ρυθμιστικό διάλυμα 10×HC RTL | 1,5 mL | 4×1,5 mL | 5×10 mL |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 mL | 2×1,5 mL | 3×10 mL |
Κατάσταση Αποθήκευσης
Μεταφορά κάτω από 0°C και αποθήκευση στους -25°C~-15°C.
Ελεγχος ποιότητας
- Υπολειμματική Δραστηριότητα τουEντονουκλεάση:Μια αντίδραση 50 μL που περιέχει 1 μg λDNA και 15 μονάδες RTL2.0 που επωάστηκαν για 16 ώρες στους 37 ℃ δείχνει το ίδιο σχέδιο με τον αρνητικό έλεγχο με ηλεκτροφόρηση γέλης.
- Υπολειμματική Δραστηριότητα τουΕξωνουκλεάση:Μια αντίδραση 50 μL που περιέχει 1 μg λDNA που έχει υποστεί πέψη Hind Ⅲ και 15 μονάδες RTL2.0 που επωάστηκαν για 16 ώρες στους 37 ℃ δείχνει το ίδιο σχέδιο με τον αρνητικό έλεγχο με ηλεκτροφόρηση γέλης.
- Υπολειμματική Δραστηριότητα τουNickase:Μια αντίδραση 50 μL που περιέχει 1 μg υπερτυλιγμένου pBR322 και 15 μονάδες RTL2.0 που επωάστηκαν για 4 ώρες στους 37°C δείχνει το ίδιο μοτίβο με τον αρνητικό έλεγχο με ηλεκτροφόρηση γέλης.
- Υπολειμματική Δραστηριότητα τουRNase:Μια αντίδραση 10 μL που περιέχει 0,48 μg MS2 RNA και 15 μονάδες RTL2.0 που επωάστηκαν για 4 ώρες στους 37°C δείχνει το ίδιο σχέδιο με τον αρνητικό έλεγχο με ηλεκτροφόρηση γέλης.
- Ε. coli gDNA:Μετριέται μεE.coliσυγκεκριμένα κιτ ανίχνευσης HCD, 15 μονάδες RTL2.0 περιέχουν λιγότερο από 1Ε. coliγονιδίωμα.
Ρύθμιση αντίδρασης
Πρωτόκολλο σύνθεσης cDNA
| Συστατικά | Ενταση ΗΧΟΥ |
| Πρότυπο RNA α | προαιρετικός |
| Oligo(dT) 18~25 (50uM) ή Random Primer mix (60uM) | 2 μL |
| Μίγμα dNTP (10mM το καθένα) | 1 μL |
| Αναστολέας RNase (40 U/uL) | 0,5 μL |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15 U/uL) | 0,5 μL |
| Ρυθμιστικό διάλυμα 10×HC RTL | 2 μL |
| Νερό χωρίς νουκλεάση | Έως 20 μL |
Σημειώσεις:
1) Η συνιστώμενη δόση Ολικού RNA είναι 1ng~1μg
2) Η συνιστώμενη δόση mRNA ήταν 50ng~100ng
Thermo-ποδηλασία Προϋποθέσεις για μια ρουτίνα αντίδραση:
| Θερμοκρασία (°C) | χρόνος |
| 25 °Ca | 5 λεπτά |
| 55 °C | 10 λεπτάb |
| 80 °C | 10 λεπτά |
Σημειώσεις:
1) Εάν χρησιμοποιείται Random Primer Mix, ένα στάδιο επώασης στους 25°C.
2) Εάν χρησιμοποιείται μίγμα εκκινητών στόχου, ένα στάδιο επώασης στους 55°C για 10~30 λεπτά.
Πρωτόκολλο RT-LAMP
| Συστατικά | Ενταση ΗΧΟΥ | Τελική Συγκέντρωση |
| Πρότυπο RNA | προαιρετικός | ≥10 αντίγραφα |
| Μίγμα dNTP (10mM) | 3,5 μL | 1,4 mM |
| Primers FIP/BIP (25×) | 1 μL | 1,6 μΜ |
| F3/B3 Primers (25×) | 1 μL | 0,2 μΜ |
| LoopF/LoopB Primers (25×) | 1 μL | 0,4 μΜ |
| Αναστολέας RNase (40U/μL) | 0,5 μL | 20 U/Αντίδραση |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/μL) | 0,5 μL | 7,5 U/Αντίδραση |
| Bst V2 DNA Πολυμεράση (8U/μL) | 1 μL | 8 U/Αντίδραση |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 μL | 6 mM (Σύνολο 8 mM) |
| Ρυθμιστικό διάλυμα 10×HC RTL (ή ρυθμιστικό διάλυμα 10×HC Bst V2) | 2,5 μL | 1 × (2mM Mg2+) |
| Νερό χωρίς νουκλεάση | Έως 25 μL | - |
Σημειώσεις:
1) Ανακατέψτε με στροβιλισμό και φυγοκεντρήστε για λίγο για να συλλέξετε.Επώαση σε σταθερή θερμοκρασία στους 65°C για 1 ώρα.
2) Τα δύο buffer είναι διαλειτουργικά και έχουν την ίδια σύνθεση.
Σημειώσεις
1. Αυτό το προϊόν θα σχηματίσει ένα λευκό στερεό όταν φυλάσσεται στους -20 °C.Το βγάζουμε από τους -20°C και το βάζουμε στον πάγο για περίπου 10 λεπτά.Μετά την τήξη, μπορεί να χρησιμοποιηθεί με ανακίνηση και ανάμειξη.
2. Το προϊόν cDNA θα μπορούσε να αποθηκευτεί στους -20°C ή -80°C ή να χρησιμοποιηθεί αμέσως για αντίδραση PCR.
3. Για να αποτρέψετε τη μόλυνση με RNase, διατηρήστε την περιοχή του πειράματος καθαρή και φοράτε καθαρά γάντια και μάσκες κατά τη λειτουργία.
