Μίνι κιτ εξαγωγής DNA
Αυτό το κιτ υιοθετεί βελτιστοποιημένο σύστημα ρυθμιστικού διαλύματος και τεχνολογία καθαρισμού στήλης πήγματος πυριτίας, που μπορεί να ανακτήσει θραύσματα DNA 70 bp – 20 kb από διάφορες συγκεντρώσεις γέλης αγαρόζης TAE ή TBE.Η στήλη προσρόφησης DNA μπορεί να προσροφήσει ειδικά το DNA υπό συνθήκες υψηλής περιεκτικότητας σε αλάτι.Επιπλέον, το κιτ μπορεί να καθαρίσει απευθείας θραύσματα DNA από προϊόντα PCR, συστήματα ενζυμικής αντίδρασης ή ακατέργαστα προϊόντα DNA που λαμβάνονται με άλλες μεθόδους και να αφαιρεί ακαθαρσίες όπως πρωτεΐνες, άλλες οργανικές ενώσεις, ανόργανα ιόντα άλατος και ολιγονουκλεοτιδικούς εκκινητές.Μπορεί να εξασφαλίσει ότι ο καθαρισμός μπορεί να ολοκληρωθεί εντός 10-15 λεπτών.Το καθαρισμένο DNA μπορεί να χρησιμοποιηθεί απευθείας για απολίνωση, μετασχηματισμό, ενζυμική πέψη, in vitro μεταγραφή, PCR, προσδιορισμό αλληλουχίας, μικροέγχυση κ.λπ.
Συνθήκες αποθήκευσης
Αποθηκεύστε στους -15 ~ -25 ℃ και μεταφέρετε σε θερμοκρασία δωματίου.
Συστατικά
| Συστατικά | (100 rxns) |
| Buffer ΑΕΠ | 80 ml |
| Buffer GW | 2 × 20 ml |
| Ρυθμιστικό διάλυμα έκλουσης | 20 ml |
| FastPure DNA Mini Columns-G | 100 |
Buffer ΑΕΠ:Ρυθμιστικό διάλυμα σύνδεσης DNA.
Buffer GW:Ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης;προσθέστε απόλυτη αιθανόλη κατά τον αναγραφόμενο όγκο στη φιάλη πριν από τη χρήση.
Ρυθμιστικό διάλυμα έκλουσης:Έκλουση.
FastPure DNA Mini Columns-G:Στήλες προσρόφησης DNA.
Σωληνάρια συλλογής 2 ml:Σωλήνες συλλογής για διήθημα.
Έτοιμα Υλικά
1,5 ml αποστειρωμένα σωληνάρια, απόλυτη αιθανόλη και ισοπροπανόλη (όταν θραύσμα DNA ≤100 bp, προσθέστε 1 όγκο
ισοπροπανόλη σε γέλη 1 όγκου), υδατόλουτρο.
Πειραματική Διαδικασία
Προσθέστε 80 ml αιθανόλης για να αραιώσετε το ρυθμιστικό GW όπως υποδεικνύεται στην ετικέτα πριν από τη χρήση, αποθηκεύστε σε θερμοκρασία δωματίου.
Μηχανισμός
1. Διάλυμα αντίδρασης PCR
Σχέδιο εκχύλισης γέλης: Προσθήκη ίσου όγκου ρυθμιστικού διαλύματος GDP PCR σχήματος ανάκτησης διαλύματος αντίδρασης:Προσθέστε 5 φορές το Buffer όγκου
2. ΑΕΠ Υπολογίστε τον όγκο της γέλης (100 μl ισούται με 100 mg)
Διαλύστε το τζελ
3. Προθερμαίνουμε στους 50-55℃
4. Bind Wash
Προσθέστε 300 μL ρυθμιστικού ΑΕΠ*
Προσθέστε 700 μL ρυθμιστικού διαλύματος GW
Προσθέστε 700 μL ρυθμιστικού διαλύματος GW
5. Elute
Προσθέστε 20 – 30 μL ρυθμιστικού διαλύματος έκλουσης ή απιονισμένου νερού
Σημειώσεις* Ανάκτηση υγρού αντίδρασης PCR χωρίς αυτό το βήμα
Πρόγραμμα εξαγωγής τζελ
1. Μετά την ηλεκτροφόρηση DNA για κλασματοποίηση θραυσμάτων DNA, αφαιρέστε τη μεμονωμένη λωρίδα του θραύσματος DNA από το πήκτωμα αγαρόζης υπό υπεριώδες φως.Συνιστάται η χρήση απορροφητικού χαρτιού για την απορρόφηση της φαινομενικής υγρασίας της γέλης και την ελαχιστοποίηση του μεγέθους της φέτας της γέλης αφαιρώντας όσο το δυνατόν περισσότερη αγαρόζη.Ζυγίστε τη φέτα γέλης (χωρίς σωλήνα μικροφυγοκέντρησης) για να υπολογίσετε τον όγκο της: Ο όγκος της φέτας πηκτής των 100 mg είναι περίπου 100 μL, με την προϋπόθεση ότι η πυκνότητα είναι 1 g/ml.
2. Προσθέστε ίσο όγκο ρυθμιστικού διαλύματος GDP, επωάστε στους 50~55℃ για 7-10 λεπτά (ανάλογα με το μέγεθος της γέλης, ρυθμίστε τον χρόνο επώασης μέχρι να διαλυθεί τελείως η γέλη).Αναστρέψτε το σωληνάριο 2 φορές κατά τη διάρκεια της επώασης.
Δ Η προσθήκη 1-3 όγκων ρυθμιστικού GDP δεν θα επηρεάσει την αποτελεσματικότητα ανάκτησης DNA.Εάν το θραύσμα DNA που πρόκειται να ανακτηθεί <100 bp, πρέπει να προστεθούν 3 όγκοι ρυθμιστικού GDP.Όταν η φέτα της γέλης έχει διαλυθεί εντελώς, προσθέστε 1 όγκο ισοπροπανόλης και ανακατέψτε καλά και μετά συνεχίστε στο επόμενο βήμα.
3. Φυγοκεντρήστε για λίγο για να φέρετε το δείγμα στον πυθμένα του σωλήνα, εισάγετε το FastPure DNA Mini Columns-G στα Σωληνάρια συλλογής 2 ml, μεταφέρετε προσεκτικά το διάλυμα το πολύ 700 μL μία φορά το
χρόνος μέχρι τις στήλες διήθησης, φυγοκεντρήστε στις 12.000 rpm (13.800 X g) για 30-60 sec.
4. Απορρίψτε το διήθημα και προσθέστε 300 μL ρυθμιστικού διαλύματος GDP στη στήλη, επωάστε σε θερμοκρασία δωματίου για 1 λεπτό, φυγοκεντρήστε στις 12.000 rpm (13.800 X g) για 30-60 δευτερόλεπτα.
5. Απορρίψτε το διήθημα και προσθέστε 700 μL ρυθμιστικού διαλύματος GW (ελέγξτε εάν έχει προστεθεί εκ των προτέρων απόλυτη αιθανόλη!) στη στήλη, φυγοκεντρήστε στις 12.000 rpm (13.800 X g) για 30-60 δευτερόλεπτα.
Δ Παρακαλούμε προσθέστε Buffer GW γύρω από το τοίχωμα της στήλης προσρόφησης ή προσθέστε Buffer GW πίσω κάλυμμα και ανακατέψτε το ανάποδα για 2 – 3 φορές για να βοηθήσετε στην πλήρη έκπλυση του αλατιού που προσκολλάται στο τοίχωμα του σωλήνα.
6. Επαναλάβετε το βήμα 5.
Δ Η έκπλυση με Buffer GW δύο φορές μπορεί να διασφαλίσει την πλήρη απομάκρυνση του αλατιού και να εξαλείψει τις επιπτώσεις στα επόμενα πειράματα.
7. Απορρίψτε το διήθημα και φυγοκεντρήστε την άδεια στήλη στις 12.000 rpm (13.800 X g) για 2 λεπτά.
8. Εισαγάγετε τη στήλη σε καθαρό σωλήνα μικροφυγοκέντρου 1,5 ml, προσθέστε 20 - 30 μL ρυθμιστικού διαλύματος έκλουσης στο κέντρο της μεμβράνης της στήλης, επωάστε για 2 λεπτά και στη συνέχεια φυγοκεντρήστε στις 12.000 rpm (13.800 X g) για 1 λεπτό.Απορρίψτε τη στήλη, αποθηκεύστε το ληφθέν DNA στους -20°C.
Δ Μεταφέροντας το υπερκείμενο του σταδίου 8 στη στήλη για εκ νέου έκλουση και προθέρμανση του ρυθμιστικού διαλύματος έκλουσης στους 55 (όταν θραύσμα DNA >3 kb) μπορεί να βοηθήσει στην αύξηση της αποτελεσματικότητας ανάκτησης.
Πρόγραμμα ανάκτησης προϊόντων PCR
Αυτό το πρωτόκολλο είναι εφαρμόσιμο για τον καθαρισμό θραυσμάτων DNA από προϊόντα PCR, σύστημα ενζυμικής αντίδρασης και άλλα ακατέργαστα προϊόντα DNA (συμπεριλαμβανομένου του γενετικού DNA).Αυτό το διάλυμα μπορεί να αφαιρέσει αποτελεσματικά διάφορα νουκλεοτίδια, εκκινητές, διμερή εκκινητών, μόρια άλατος, ένζυμα και άλλες ακαθαρσίες.
1. Φυγοκεντρήστε σύντομα τα προϊόντα PCR, το διάλυμα ενζυμικής αντίδρασης και άλλα ακατέργαστα προϊόντα DNA.Υπολογίστε τον όγκο τους με πιπέτα και μεταφέρετε σε αποστειρωμένο σωληνάριο 1,5 ml ή 2 ml.Προσθέστε ddH2O μέχρι ο όγκος να φτάσει τα 100 μL.ενώ για γονιδιωματικό DNA με υψηλή συγκέντρωση, η αραίωση στα 300 μL με ddH2O θα συμβάλει στη βελτίωση της αποτελεσματικότητας ανάκτησης.
2. Προσθέστε 5 όγκους Buffer GDP, ανακατέψτε καλά με αναστροφή ή στροβιλισμό.Εάν θραύσμα DNA ενδιαφέροντος >100 bp, πρέπει να προστεθούν επιπλέον 1,5 όγκοι (δείγματα + ρυθμιστικό GDP) αιθανόλης.
3. Εισαγάγετε τη στήλη ξανά στο σωλήνα συλλογής, μεταφέρετε το μείγμα στη στήλη, φυγοκεντρήστε στις 12.000 rpm (13.800 ×g) για 30 – 60 δευτερόλεπτα.Εάν ο όγκος του αναμεμειγμένου διαλύματος είναι >700 µL, τοποθετήστε τη στήλη προσρόφησης ξανά στο σωλήνα συλλογής, μεταφέρετε το υπόλοιπο διάλυμα στη στήλη προσρόφησης και φυγοκεντρήστε στις 12.000 rpm (13.800 × g) για 30 – 60 δευτερόλεπτα.
4. Η επόμενη απόδοση αναφέρεται στο βήμα 5 – 8 του προγράμματος εξαγωγής 08- 1/Gel.
Εφαρμογές
Διάφορες συγκεντρώσεις γέλης αγαρόζης TAE ή TBE.Προϊόντα PCR, συστήματα ενζυμικής αντίδρασης ή άλλα ακατέργαστα προϊόντα DNA που λαμβάνονται με διάφορες μεθόδους.Τα ανακτημένα θραύσματα κυμαίνονταν από70 bp -20 kb.
Σημειώσεις
Μόνο για ερευνητική χρήση.Δεν προορίζεται για χρήση σε διαγνωστικές διαδικασίες.
1. Προσθέστε 80 ml αιθανόλης για να αραιώσετε το ρυθμιστικό GW όπως υποδεικνύεται στην ετικέτα πριν από τη χρήση, αποθηκεύστε σε θερμοκρασία δωματίου.
2. Εάν το Buffer GDP είναι εύκολο να κατακρημνιστεί κατά την αποθήκευση σε χαμηλή θερμοκρασία, μπορεί να τοποθετηθεί σε θερμοκρασία δωματίου για ένα χρονικό διάστημα πριν από τη χρήση.Εάν είναι απαραίτητο, μπορεί να προθερμανθεί σε λουτρό νερού 37℃ μέχρι να διαλυθεί πλήρως το ίζημα και στη συνέχεια μπορεί να χρησιμοποιηθεί μετά την ανάμειξη.
3. Ρυθμίστε τη θερμοκρασία λουτρού νερού στους 50 ~ 55℃ εκ των προτέρων.
4. Στο βήμα 1 του προγράμματος εκχύλισης 08-1/Gel, η ελαχιστοποίηση του μεγέθους της φέτας γέλης θα μειώσει σημαντικά τον χρόνο διάλυσης και θα αυξήσει την απόδοση ανάκτησης (Το γραμμικό DNA υδρολύεται εύκολα όταν εκτίθεται συνεχώς σε υψηλή θερμοκρασία).Μην εκθέτετε το τζελ DNA σε υπεριώδη ακτινοβολία για μεγάλο χρονικό διάστημα, καθώς το υπεριώδες φως μπορεί να προκαλέσει βλάβη στο DNA.
5. Διαλύστε πλήρως το τζελ στο βήμα 2 του προγράμματος εκχύλισης 08- 1/Gel, διαφορετικά η αποτελεσματικότητα ανάκτησης DNA θα επηρεαστεί σοβαρά.
6. Προθερμάνετε το ρυθμιστικό διάλυμα έκλουσης ή το ddH2O στους 55℃, το οποίο είναι χρήσιμο για τη βελτίωση της αποτελεσματικότητας έκλουσης DNA.Συνιστάται η αποθήκευση DNA σε υγρό έκλουσης 2,5 mM Tris-HCl, pH 7,0 – 8,5.
