EndoFree Plasmid Maxi Kit

Συνθήκες αποθήκευσης

Το RNaseA πρέπει να αποθηκεύεται στους -30 ~ -15 ℃ και να μεταφέρεται στους ≤0 ℃ .

Το Endotoxin Scavenger μπορεί να αποθηκευτεί στους 2 ~ 8 ℃ για ένα μήνα, αποθηκευμένο στους -30 ~ -15 ℃ για μακροχρόνια αποθήκευσηκαι μεταφέρθηκε στους ≤0℃.

Άλλα συστατικά πρέπει να φυλάσσονται σε θερμοκρασία δωματίου (15 ~ 25 ℃) και να μεταφέρονται σε θερμοκρασία δωματίου.

Συστατικά

RNaseA:10 mg/ml, που χρησιμοποιείται για την αφαίρεση του RNA.

Buffer P1:ρυθμιστικό διάλυμα βακτηριακού εναιωρήματος, προσθέστε το RNaseA στο ρυθμιστικό διάλυμα P1 πριν από την πρώτη χρήση.

Buffer P2:ρυθμιστικό βακτηριακής λύσης (που περιέχει SDS/NaOH).

Buffer P4:εξουδετερωτικό ρυθμιστικό διάλυμα.

Καθαριστής ενδοτοξινών:απομακρύνει αποτελεσματικά την ενδοτοξίνη από το ακατέργαστο εκχύλισμα πλασμιδίου.

Buffer PW:ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης, προσθέστε τον προβλεπόμενο όγκο αιθανόλης πριν από την πρώτη χρήση.

Buffer TB:ρυθμιστικό έκλουσης.

Στήλες FastPure DNA Maxi:στήλες προσρόφησης πλασμιδικού DNA.

Σωληνάρια συλλογής 50 ml:σωλήνες συλλογής διηθήματος.

Σωληνάριο συλλογής χωρίς ενδοτοξίνες:σωλήνες συλλογής DNA πλασμιδίου.

Έτοιμα Υλικά

Απόλυτη αιθανόλη, ισοπροπανόλη, φυγοκεντρικοί σωλήνες 50 ml με στρογγυλό πυθμένα και 50 ml χωρίς ενδοτοξίνεςσωλήνες φυγοκέντρησης.

Εφαρμογές

Αυτό το προϊόν είναι κατάλληλο για μεγάλης κλίμακας εκχύλιση πλασμιδίων από 150 - 300 ml βακτηριακού διαλύματοςκαλλιεργείται ολονύκτια.

Πειραματική Διαδικασία

1. Πάρτε 150 – 200 ml (όχι περισσότερο από 300 ml) βακτηριακού διαλύματος που καλλιεργήθηκε όλη τη νύχτα και φυγοκεντρήστε σεπερίπου 11.000 rpm (12.000 × g) για 1 – 2 λεπτά.Απορρίψτε το υπερκείμενο και συλλέξτε βακτήρια.

Δ Όταν συλλέγονται περισσότερα από 50 ml βακτηριακού διαλύματος, τα βακτήρια μπορούν να συλλεχθούν με προσθήκη βακτηριακού διαλύματος, φυγοκέντρηση, απόρριψη του υπερκειμένου και άλλα βήματα στον ίδιο σωλήνα των 50 ml για

πολλαπλές φορές.

2. Προσθέστε 7,5 ml ρυθμιστικού διαλύματος P1 (ελέγξτε εάν έχει προστεθεί RNaseA στο ρυθμιστικό διάλυμα P1) στη φυγόκεντροσωληνάριο που περιέχει βακτήρια και αναμειγνύεται επιμελώς με στροβιλισμό ή με πιπέτα.

Δ Η πλήρης εκ νέου εναιώρηση των βακτηρίων σε αυτό το βήμα είναι κρίσιμης σημασίας για την απόδοση και δεν θα πρέπει να υπάρχουν βακτηριακές συστάδες μετά την εκ νέου εναιώρηση.Εάν υπάρχουν μάζες βακτηρίων που δεν αναμειγνύονται καλά, θα επηρεάσει τη λύση, με αποτέλεσμα χαμηλή απόδοση και καθαρότητα.Εάν το OD600 του βακτηριακού διαλύματος είναι 0,65, συνιστάται η χρήση 7,5 ml ρυθμιστικού διαλύματος P1 κατά την εκχύλιση από 150 ml βακτηριακού διαλύματος.όταν το OD600 είναι 0,75, θα πρέπει να χρησιμοποιηθούν 8 ml ρυθμιστικού διαλύματος P1 και οι όγκοι των ρυθμιστικών διαλυμάτων P2 και P4 θα πρέπει να αλλάξουν ανάλογα.Εάν ο όγκος του βακτηριακού διαλύματος αυξηθεί στα 200 ml, συνιστάται ηο όγκος των ρυθμιστικών διαλυμάτων P1, P2 και P4 να αυξηθεί αναλογικά.

3. Προσθέστε 7,5 ml ρυθμιστικού διαλύματος P2 στο βακτηριακό εναιώρημα από το βήμα 2 και ανακατέψτε απαλά πάνω-κάτω για 6 – 8φορές και επωάστε σε θερμοκρασία δωματίου για 4 – 5 λεπτά.

Δ Αναποδογυρίζουμε απαλά για να αναμειχθεί καλά.Ο στροβιλισμός θα προκαλέσει τον κατακερματισμό του γονιδιωματικού DNA, με αποτέλεσμα θραύσματα γονιδιωματικού DNA στο εξαγόμενο πλασμίδιο.Αυτή τη στιγμή, το διάλυμα γίνεται παχύρρευστο και ημιδιαφανές, δείχνοντας ότι τα βακτήρια έχουν λυθεί πλήρως.Η διάρκεια δεν πρέπει να υπερβαίνει τα 5 λεπτά για να αποφευχθεί η καταστροφή των πλασμιδίων.Εάν το διάλυμα δεν είναι διαυγές, μπορεί να προκύψουν πάρα πολλά βακτήριαατελής λύση, επομένως η ποσότητα των βακτηρίων θα πρέπει να μειωθεί κατάλληλα.

4. Προσθέστε 7,5 ml ρυθμιστικού διαλύματος P4 στο βακτηριακό εναιώρημα από το βήμα 3 και αναστρέψτε αμέσως απαλά 6 – 8 φορές για να επιτρέψετε στο διάλυμα να εξουδετερώσει πλήρως το ρυθμιστικό διάλυμα P2.Αυτή τη στιγμή, θα πρέπει να εμφανιστεί λευκό κροκιδωτικό ίζημα.Φυγοκεντρήστε σε περισσότερες από περίπου 11.000 rpm (12.000 × g) για 10 – 15 λεπτά, μεταφέρετε προσεκτικά το υπερκείμενο σε πιπέτα σε νέο φυγοκεντρικό σωλήνα 50 ml με στρογγυλό πυθμένα (αυτοπαρασκευασμένο) και αποφύγετεαναρροφήστε το επιπλέον λευκό ίζημα.

Δ Προσθέστε ρυθμιστικό διάλυμα P4 και αναποδογυρίστε αμέσως για να αναμειχθεί καλά.Αφήστε το σωληνάριο σε ηρεμία έως ότου το λευκό ίζημα κατανεμηθεί ομοιόμορφα σε όλο το διάλυμα για να αποτρέψετε την παραγωγή τοπικής καθίζησης που θα μπορούσε να επηρεάσει την εξουδετέρωση.Εάν δεν υπάρχει ομοιόμορφο λευκό κροκιδωτικό ίζημα πριν από τη φυγοκέντρηση και το υπερκείμενο υγρό δεν είναι διαυγές μετά τη φυγοκέντρηση, ο σωλήνας μπορεί ναφυγοκεντρήθηκε για άλλα 5 λεπτά.

5. Προσθέστε 0, 1 φορές τον όγκο (10% του όγκου του υπερκειμένου, περίπου 2,2 ml) του Endotoxin Scavenger στο υπερκείμενο από το βήμα 4 και αναστρέψτε το για να αναμειχθεί.Τοποθετήστε το διάλυμα σε λουτρό πάγου ή εισάγετε σε θρυμματισμένο πάγο (ή καταψύκτη) για 5 λεπτά έως ότου το διάλυμα αλλάξει από θολό σε διαυγές και διαφανές (ή ακίνητοελαφρώς θολό) και περιστασιακά ανακατεύουμε αρκετές φορές.

Δ Αφού προστεθεί το Endotoxin Scavenger στο υπερκείμενο, το υπερκείμενο θα γίνει θολό αλλάΤο υπερκείμενο πρέπει να γίνει διαυγές (ή ελαφρώς θολό) μετά την ψύξη στο λουτρό πάγου.

6. Αφού το υπερκείμενο τοποθετηθεί σε θερμοκρασία δωματίου (>25℃) για 10 – 15 λεπτά, θα γίνει θολό καθώςη θερμοκρασία του αυξάνεται σε θερμοκρασία δωματίου.Στη συνέχεια, το υπερκείμενο πρέπει να αναστραφεί για να αναμειχθεί.

Δ Εάν η θερμοκρασία δωματίου είναι χαμηλότερη ή θέλετε να μειώσετε τον χρόνο εκχύλισης, το υπερκείμενο μπορεί να επωαστεί σε υδατόλουτρο 37 ~ 42 ℃ για 5 – 10 λεπτά και το επόμενο βήμα μπορεί να πραγματοποιηθεί μετά το υπερκείμενογίνεται θολό.

7. Φυγοκεντρήστε το υπερκείμενο σε περίπου 11.000 rpm (12.000 × g) για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (η θερμοκρασία πρέπει να είναι >25℃) για να διαχωριστεί η φάση.Η ανώτερη υδατική φάση περιέχει το DNA ενώ η κατώτερη μπλε ελαιώδης φάση περιέχει ενδοτοξίνη και άλλες ακαθαρσίες.Μεταφέρετε τουδατική φάση που περιέχει DNA σε νέο σωλήνα καιπετάξτε το λιπαρό στρώμα.

Δ Η θερμοκρασία κατά τη διάρκεια της φυγοκέντρησης πρέπει να είναι πάνω από 25℃ καθώς ο αποτελεσματικός διαχωρισμός φάσεων δεν το κάνεισυμβεί εάν η θερμοκρασία είναι πολύ χαμηλή.

Δ Εάν ο διαχωρισμός φάσης δεν είναι αποτελεσματικός, η θερμοκρασία φυγοκέντρησης μπορεί να ρυθμιστεί στους 30℃ καιο χρόνος φυγοκέντρησης μπορεί να αυξηθεί στα 15 λεπτά.

Δ Μην πιπιλίζετε το μπλε λιπαρό στρώμα καθώς περιέχει ενδοτοξίνη και άλλες ακαθαρσίες.

Μηχανισμός

Εξουδετέρωση λύσης επανααιώρησης

◇ Προσθέστε 7,5 ml ρυθμιστικού διαλύματος P1

◇ Προσθέστε 7,5 ml ρυθμιστικού διαλύματος P2

◇ Προσθέστε 7,5 ml ρυθμιστικού διαλύματος P4

Αφαίρεση ενδοτοξίνης

◇Προσθέστε 0, 1 φορές τον όγκο του υπερκειμένου του Endotoxin Scavenger

Δέσιμο και Πλύσιμο

◇ Προσθέστε 0,5 φορές τον όγκο της ισοπροπανόλης

◇ Προσθέστε 10 ml ρυθμιστικού διαλύματος PW