Κιτ άμεσης PCR φυτών

Αριθμός γάτας: HCR2020A

Το Plant Direct PCR Kit είναι κατάλληλο για άμεση ενίσχυση φύλλων φυτών, σπόρων κ.λπ., και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για διαλογή υψηλής απόδοσης φυτικών δειγμάτων που δεν περιέχουν πολυσακχαρίτες και πολυφαινόλες.Η άμεση ενίσχυση DNA πολυμεράση που βασίζεται στην κατευθυνόμενη εξέλιξη έχει ανώτερη ανοχή σε αναστολείς PCR στα φυτά.Εν τω μεταξύ, διατηρεί την υψηλή απόδοση ενίσχυσης, η οποία είναι κατάλληλη για την ενίσχυση θραυσμάτων DNA εντός 5 kb.Το μοναδικό ρυθμιστικό διάλυμα Lysis A στο κιτ μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη λύση φρέσκων ή κατεψυγμένων φυτικών ιστών.Είναι εύκολο να λειτουργήσει και το προϊόν λύσης μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως πρότυπο για ενίσχυση χωρίς καθαρισμό.Το σύστημα περιέχει προστατευτικούς παράγοντες που επιτρέπουν στα ακατέργαστα δείγματα να ενισχυθούν αποτελεσματικά μετά από επαναλαμβανόμενη κατάψυξη και απόψυξη.Το 2 × Το Plant Direct Master Mix χρειάζεται μόνο να προσθέσει εκκινητές και πρότυπα για να εκτελέσει την αντίδραση ενίσχυσης, μειώνοντας έτσι τις λειτουργίες πιπέτας και βελτιώνοντας την απόδοση ανίχνευσης και την αναπαραγωγιμότητα των αποτελεσμάτων.

Συστατικά

*Το Plant Direct Lysis Buffer B είναι ένα προαιρετικό αντιδραστήριο, το οποίο χρησιμοποιείται για την εξουδετέρωση του Plant Direct Lysis Buffer A για την παράταση του χρόνου αποθήκευσης των δειγμάτων.Μπορεί να χρησιμοποιηθεί σύμφωνα με την πραγματική κατάσταση.

Συνθήκες αποθήκευσης

2 × Φυτέψτε το Direct Master Mix, αποθηκεύστε στους -30 ~ -15 ℃ και αποφύγετε την επαναλαμβανόμενη κατάψυξη και απόψυξη.Φυτέψτε το ρυθμιστικό διάλυμα άμεσης λύσης, αποθηκεύστε στους -30 ~ -15 ℃ ή 2 ~ 8 ℃.

Πειραματική Διαδικασία

Επεξεργασία δειγμάτων–Φύλλο φυτού

Άμεση μέθοδος:Συνιστάται η χρήση νεαρών φύλλων.Χρησιμοποιήστε μια διάτρηση οπής σταθερής διαμέτρου 0,5 – 3 mm για να αποκτήσετε ένα μικρό και ομοιόμορφο δείγμα και, στη συνέχεια, προσθέστε απευθείας το δείγμα στο σύστημα PCR (συνιστάται σύστημα 50 μl).Σημείωση, βεβαιωθείτε ότι το δείγμα βρίσκεται στο διάλυμα PCR και όχι στο τοίχωμα του σωλήνα.Εάν χρησιμοποιείται άμεση PCR για την ενίσχυση μακρών θραυσμάτων και σύνθετων δειγμάτων, η χρήση ενός δείγματος με μικρότερη διάμετρο (0,5 – 1 mm) ως πρότυπο μπορεί να βοηθήσει στην επίτευξη καλύτερων αποτελεσμάτων.

Μέθοδος λύσης λείανσης:Συνιστάται η χρήση νεαρών φύλλων.Πάρτε ένα μικρό κομμάτι φύλλου (περίπου 1 – 3 mm σε διάμετρο), τοποθετήστε το σε 20 μl Plant Direct Lysis Buffer Ab και αλέστε το όσο το δυνατόν περισσότερο (αυτό το βήμα μπορεί να γίνει πιέζοντας το φύλλο με μια άκρη πιπέτας 100 μl για να πολτοποιήσετε το δείγμα) .Εάν χρησιμοποιούνται μεγαλύτεροι όγκοι ιστού φύλλων (δεν υπερβαίνουν τα 7 mm), αυξήστε τον όγκο του ρυθμιστικού διαλύματος αραίωσης στα 50 μl.Αφού αλέθονται τα φύλλα, το διάλυμα πρέπει να φαίνεται πράσινο.Μετά από μια σύντομη φυγοκέντρηση, προσθέστε 1 μl του υπερκειμένου στο σύστημα PCR ως πρότυπο αντίδρασης.

Μέθοδος θερμικής λύσης:Συνιστάται η χρήση νεαρών φύλλων.Πάρτε ένα μικρό κομμάτι φύλλου (διαμέτρου περίπου 1 – 3 mm), τοποθετήστε το σε 20 μl Ρυθμιστικό διάλυμα Άμεσης Λύσης Φυτών και θερμαίνετε το στους 95°C για 5 – 10 λεπτά.Ο χρόνος λύσης μπορεί να παραταθεί κατάλληλα για φύλλα που είναι δύσκολο να λυθούν (όχι περισσότερο από 20 λεπτά).Εάν χρησιμοποιούνται μεγαλύτεροι όγκοι ιστού φύλλων (δεν υπερβαίνουν τα 7 mm), αυξήστε τον όγκο του ρυθμιστικού διαλύματος αραίωσης στα 50 μl.Μετά τη θέρμανση, φυγοκεντρήστε για λίγο και προσθέστε 1 μl υπερκειμένου στο σύστημα PCR ως πρότυπο αντίδρασης.

Επεξεργασία δειγμάτων– Φυτός σπόρος

Μέθοδος λύσης λείανσης:Χρησιμοποιήστε ένα νυστέρι για να κόψετε σπόρους με διάμετρο 5 mm, προσθέστε τους σε 100 μl ρυθμιστικού διαλύματος Άμεσης λύσης φυτού Α και αλέστε το δείγμα με μύτη πιπέτας ή άλλα εργαλεία.Ανακατέψτε για λίγο και αφήστε το σε θερμοκρασία δωματίου για 3 – 5 λεπτά.Βεβαιωθείτε ότι το δείγμα σπόρων είναι βυθισμένο στο ρυθμιστικό διάλυμα αραίωσης.Μετά από μια σύντομη φυγοκέντρηση, προσθέστε 1 μl του υπερκειμένου στο σύστημα PCR ως πρότυπο αντίδρασης.

Μέθοδος θερμικής λύσης:Χρησιμοποιήστε ένα νυστέρι για να κόψετε σπόρους με διάμετρο 5 mm, προσθέστε τους σε 100 μl ρυθμιστικού διαλύματος Άμεσης λύσης φυτού Α και θερμάνετε στους 95°C για 5 – 10 λεπτά.Ο χρόνος λύσης μπορεί να παραταθεί κατάλληλα για φύλλα που είναι δύσκολο να λυθούν (όχι περισσότερο από 30 λεπτά).Μετά τη θέρμανση, φυγοκεντρήστε για λίγο και προσθέστε 1 μl υπερκειμένου στο σύστημα PCR ως πρότυπο αντίδρασης.

ένα.Ψαλίδι ή άλλα εργαλεία μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν για την κοπή δειγμάτων κατάλληλου μεγέθους.Εάν η διάτρηση ή το ψαλίδι επαναχρησιμοποιηθούν, θα πρέπει να καθαρίζονται με διάλυμα υποχλωριώδους νατρίου 2% πριν από κάθε χρήση για να αποφευχθεί η διασταυρούμενη μόλυνση μεταξύ των δειγμάτων.

σι.Βεβαιωθείτε ότι το Plant Direct Lysis Buffer έχει λιώσει πλήρως πριν από τη χρήση.Εάν το ρυθμιστικό διάλυμα είναι παχύρρευστο ή έχει ιζήματα, μπορεί να θερμανθεί στους 37℃ για να λιώσει τελείως πριν από τη χρήση.

ντο.Ο όγκος του εκμαγείου στο σύστημα αντίδρασης μπορεί να ρυθμιστεί κατάλληλα ανάλογα με τη διαφορά στον όγκο του φυτικού υλικού και του αραιωτικού που προστίθεται.

Ρυθμιστικό διάλυμα άμεσης λύσης φυτών

Το Plant Direct Lysis Buffer A που περιέχεται σε αυτό το προϊόν έχει βελτιστοποιηθεί αυστηρά για να απελευθερώνει το γονιδίωμα των περισσότερων φυτικών ιστών και είναι κατάλληλο για βραχυπρόθεσμη αποθήκευση ακατέργαστων φυτών στους 4℃.Εάν το δείγμα χρειάζεται να αποθηκευτεί για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα (π.χ. 1 – 2 μήνες), συνιστάται η μεταφορά του υπερκειμένου σε νέο σωλήνα EP και η αποθήκευση του στους -20℃.Για να αποθηκεύσετε τα δείγματα πιο σταθερά, προσθέστε ίσο όγκο ρυθμιστικού διαλύματος άμεσης λύσης φυτών Β στο μεταφερόμενο υπερκείμενο, ανακατέψτε καλά και αποθηκεύστε στους -20℃.Ο σταθερός χρόνος αποθήκευσης ποικίλλει ανάλογα με τα δείγματα και τις καταστάσεις των φυτών.

Σύστημα Αντίδρασης

ένα.Περιέχει Mg²⁺σε τελική συγκέντρωση 2 mM.

σι.Συνιστάται η χρήση τελικής συγκέντρωσης 0,4μM για κάθε αστάρι.Η υπερβολική χρήση εκκινητών θα οδηγήσει σε αυξημένη μη ειδική ενίσχυση.

ντο.Η ποσότητα του χρησιμοποιούμενου δείγματος μπορεί να προσαρμοστεί ανάλογα με την πραγματική κατάσταση.Η ποσότητα που χρησιμοποιείται σε μία μόνο αντίδραση ακατέργαστου δείγματος λύσης μπορεί να ρυθμιστεί μεταξύ 2% – 20% του συνολικού όγκου της αντίδρασης.Η χρήση πολλών δειγμάτων μπορεί να προκαλέσει αποτυχία ενίσχυσης.

Πρόγραμμα Αντίδρασης

ένα.Η αρχική μετουσίωση (98℃, 5 λεπτά) προάγει τη λύση του φυτικού ιστού, απελευθερώνοντας γονιδιωματικό DNA που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για ενίσχυση PCR.Μην μειώνετε το χρόνο και μην μειώνετε τη θερμοκρασία.

σι.Συνιστάται να το ορίσετε ίσο με την τιμή του ασταριού Tm ή 2 ~ 4℃ υψηλότερη από την τιμή Tm.Η άμεση ενίσχυση DNA πολυμεράση που χρησιμοποιείται σε αυτό το προϊόν είναι διαφορετική από τη συμβατική Taq DNA πολυμεράση και έχει ειδικές απαιτήσεις για τη θερμοκρασία ανόπτησης αντίδρασης. Η χρήση υψηλής θερμοκρασίας ανόπτησης μπορεί να μειώσει αποτελεσματικά τη μη ειδική ενίσχυση και να βελτιώσει την αποτελεσματικότητα της ενίσχυσης.Για πολύπλοκα πρότυπα, η αποτελεσματική ενίσχυση μπορεί να επιτευχθεί με προσαρμογή της θερμοκρασίας ανόπτησης και παράταση του χρόνου επέκτασης.

ντο.Εάν το μήκος του προϊόντος ενίσχυσης είναι ≤1 kb, ο χρόνος επέκτασης ορίζεται στα 30 sec/kb.εάν το μήκος του προϊόντος ενίσχυσης είναι >1 kb, ο χρόνος επέκτασης ορίζεται στα 60 sec/kb.

ρε.Για σύνθετα δείγματα ή δείγματα με χαμηλή απόδοση ενίσχυσης, ο αριθμός των κύκλων μπορεί να αυξηθεί κατάλληλα σε 40 -50 κύκλους.

Εφαρμογές

Εφαρμόζεται για άμεση ενίσχυση φυτικών ιστών και διαλογή υψηλής απόδοσης φυτικών δειγμάτων που δεν περιέχουν πολυσακχαρίτες και πολυφαινόλες.

Σημειώσεις

Μόνο για ερευνητική χρήση.Δεν προορίζεται για χρήση σε διαγνωστικές διαδικασίες.

1. Για ακατέργαστη ενίσχυση φυτών ή άμεση ενίσχυση, συνιστάται η χρήση καθαρισμένου γονιδιωματικού DNA ως θετικού μάρτυρα πριν από την έναρξη του πειράματος για να διασφαλιστεί ότι το σύστημα, οι εκκινητές και οι λειτουργίες είναι σωστές.

2. Η πολυμεράση DNA άμεσης ενίσχυσης που χρησιμοποιείται σε αυτό το κιτ έχει ισχυρή διόρθωση διόρθωσης.Εάν χρειάζεται να πραγματοποιηθεί κλωνοποίηση ΤΑ, συνιστάται ο καθαρισμός του DNA πριν από την προσθήκη της αδενίνης.

3. Οδηγίες σχεδίασης Primer：

ένα.Συνιστάται η τελευταία βάση στο 3′ άκρο του ασταριού να είναι G ή C.

σι.Θα πρέπει να αποφεύγονται διαδοχικές αναντιστοιχίες στις τελευταίες 8 βάσεις στο 3′ άκρο του ασταριού.ντο.Αποφύγετε τις δομές φουρκέτας στο 3′ άκρο του ασταριού.

ρε.Οι διαφορές στην τιμή Tm του μπροστινού ασταριού και του αντίστροφου ασταριού δεν πρέπει να είναι περισσότερες από 1℃ και η τιμή Tm πρέπει να ρυθμιστεί σε 60 ~ 72℃ (το Primer Premier 5 συνιστάται για τον υπολογισμό της τιμής Tm).

μι.Επιπλέον πρόσθετες αλληλουχίες εκκινητών που δεν ταιριάζουν με το πρότυπο, δεν θα πρέπει να περιλαμβάνονται κατά τον υπολογισμό της τιμής του εκκινητή Tm.

φά.Συνιστάται η περιεκτικότητα σε GC του ασταριού να είναι 40% -60%.

σολ.Η συνολική κατανομή των A, G, C και T στον εκκινητή πρέπει να είναι όσο το δυνατόν πιο ομοιόμορφη.Αποφύγετε τη χρήση περιοχών με υψηλή περιεκτικότητα GC ή AT.

η.Αποφύγετε την παρουσία συμπληρωματικών αλληλουχιών 5 ή περισσότερων βάσεων είτε εντός του εκκινητή είτε μεταξύ δύο εκκινητών και αποφύγετε την παρουσία συμπληρωματικών αλληλουχιών 3 ή περισσότερων βάσεων στο 3' άκρο δύο εκκινητών.

Εγώ.Χρησιμοποιήστε τη λειτουργία NCBI BLAST για να ελέγξετε την ειδικότητα του εκκινητή για να αποτρέψετε τη μη ειδική ενίσχυση.