Ουρακίλη DNA Γλυκοσυλάση
Η Ουρακίλη-DNA Γλυκοσυλάση (UNG ή UDG) είναι ένας ανασυνδυασμένος κλώνος του E.coli με μοριακό βάρος 25 kDa.Καταλύει την απελευθέρωση ελεύθερης ουρακίλης από μονόκλωνο και δίκλωνο DNA που περιέχει ουρακίλη και είναι ανενεργό έναντι του RNA και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την πρόληψη της μόλυνσης των προϊόντων ενίσχυσης PCR.Η αρχή της δράσης βασίζεται στο γεγονός ότι εάν το dUTP αντικαταστήσει το dTTP στην αντίδραση PCR και σχηματιστεί ένα προϊόν ενίσχυσης PCR που περιέχει βάσεις dU, το ένζυμο μπορεί επιλεκτικά να σπάσει τον γλυκοσιδικό δεσμό των βάσεων U σε μονόκλωνες και δίκλωνες DNA και αποικοδομήστε το προϊόν ενίσχυσης PCR.
Προτεινόμενη Εφαρμογή
Ενίσχυση πρόληψης μόλυνσης
Κατάσταση Αποθήκευσης
-20°C για μακροχρόνια αποθήκευση, πρέπει να αναμειγνύεται καλά πριν από τη χρήση, να αποφεύγεται η συχνή κατάψυξη-απόψυξη.
Αποθηκευτικός χώρος αποθήκευσης
20 mM Tris-HCl (ρΗ 8,0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, Σταθεροποιητής, 50% Γλυκερόλη.
Ορισμός μονάδας
Η ποσότητα του ενζύμου που απαιτείται για την αποικοδόμηση 1 μg μονόκλωνου DNA που περιέχει βάσεις dU σε 1 ώρα στους 37°C είναι 1 μονάδα.
Ελεγχος ποιότητας
1.ηλεκτροφορητική καθαρότητα SDS-PAGE μεγαλύτερη από 98%
2.Ευαισθησία ενίσχυσης, έλεγχος παρτίδας σε παρτίδα, σταθερότητα
3.Αφού υποβληθεί σε επεξεργασία 1U UNG στους 50℃ για 2 λεπτά, το πρότυπο που περιέχει U κάτω από 103 αντίγραφα θα πρέπει να υποβαθμιστεί πλήρως και δεν μπορεί να παραχθεί προϊόν ενίσχυσης
4.Καμία εξωγενής δράση νουκλεάσης
Οδηγίες
| Συστατικά | Όγκος (μL) | Τελική συγκέντρωση |
| 10 × Ρυθμιστικό διάλυμα PCR (χωρίς dNTP, Mg²+Ελεύθερος) | 5 | 1× |
| dUTPs (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 μΜ |
| dUTP (αντικαταστήστε το dTTP) | - | 200-600 μΜ |
| 25 mM MgCl2 | 2-8 μL | 1-4 mM |
| 5 U/μL Taq | 0,25 | 1,25 U |
| 5 U/μL UNG | 0,25 (0,1-0,5) | 0,25 U (0,1-0,5) |
| 25 × Μίγμα ασταριούένα | 2 | 1× |
| Πρότυπο | - | ＜1μg/αντίδραση |
| ddH2O | Μέχρι 50 | - |
Σημείωση: α: Εάν χρησιμοποιείται για qPCR/qRT-PCR, ο φθορίζων ανιχνευτής θα πρέπει να προστεθεί στο σύστημα αντίδρασης.Συνήθως, μια τελική συγκέντρωση εκκινητή 0,2 μΜ μπορεί να δώσει καλά αποτελέσματα.όταν η απόδοση της αντίδρασης είναι κακή, η συγκέντρωση του εκκινητή μπορεί να ρυθμιστεί στην περιοχή από 0,2-1 μΜ.Συνήθως, η συγκέντρωση του ανιχνευτή βελτιστοποιείται στην περιοχή από 0,1-0,3 μM.Μπορούν να πραγματοποιηθούν πειράματα βαθμίδωσης συγκέντρωσης για να βρεθεί ο καλύτερος συνδυασμός εκκινητή και ανιχνευτή.
Σημειώσεις
1.Το ένζυμο UNG μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την αφαίρεση των μολυσμένων προϊόντων ενίσχυσης dUTP από το σύστημα αντίδρασης πριν από την αντίδραση ενίσχυσης PCR, και στη συνέχεια για την αποφυγή ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων λόγω μόλυνσης του προϊόντος.
2.Η βέλτιστη θερμοκρασία για το ένζυμο UNG που θα χρησιμοποιηθεί στην αντίδραση PCR κατά της μόλυνσης είναι γενικά 50℃ για 2 λεπτά.η κατάσταση αδρανοποίησης είναι 95℃ για 5 λεπτά.
3.Αποφύγετε τη συχνή κατάψυξη-απόψυξη και μην την εκθέτετε σε μεγάλες διακυμάνσεις της θερμοκρασίας.
4.Διαφορετικά γονίδια προς ενίσχυση έχουν διαφορετική απόδοση χρήσης του dUTP και ευαισθησία στο ένζυμο UNG, επομένως, εάν η χρήση του συστήματος UNG οδηγεί σε μείωση της ευαισθησίας ανίχνευσης, το σύστημα αντίδρασης θα πρέπει να προσαρμοστεί και να βελτιστοποιηθεί. Εάν χρειάζεστε τεχνική υποστήριξη, επικοινωνήστε η ΕΤΑΙΡΕΙΑ μας.
