Αναστολέας Rnase
Ο αναστολέας RNase ποντικού είναι ένας ανασυνδυασμένος αναστολέας RNase ποντικού που εκφράζεται και καθαρίζεται από E.coli.Προσδένεται στη RNase A, B ή C σε αναλογία 1:1 μέσω μη ομοιοπολικού δεσμού, αναστέλλοντας έτσι τη δραστηριότητα των τριών ενζύμων και προστατεύοντας το RNA από την αποικοδόμηση.Ωστόσο, δεν είναι αποτελεσματικό έναντι της RNase 1, RNase T1, S1 Nuclease, RNase H ή RNase από Aspergillus.Ο αναστολέας RNase ποντικού δοκιμάστηκε με RT-PCR, RT-qPCR και IVT mRNA, και ήταν συμβατός με διάφορες εμπορικές Αντίστροφες μεταγραφάσες, DNA πολυμεράσες και RNA πολυμεράσες.
Σε σύγκριση με τους ανθρώπινους αναστολείς RNase, ο αναστολέας RNase ποντικού δεν περιέχει δύο κυστεΐνες που είναι ιδιαίτερα ευαίσθητες στην οξείδωση που προκαλεί αδρανοποίηση του αναστολέα.Αυτό το καθιστά σταθερό σε χαμηλές συγκεντρώσεις DTT (λιγότερο από 1 mM).Αυτό το χαρακτηριστικό το καθιστά κατάλληλο για χρήση σε αντιδράσεις όπου οι υψηλές συγκεντρώσεις DTT είναι δυσμενείς για την αντίδραση (π.χ. RT-PCR σε πραγματικό χρόνο).
Aεφαρμογή
Αυτό το προϊόν μπορεί να χρησιμοποιηθεί ευρέως σε οποιοδήποτε πείραμα όπου είναι δυνατή η παρεμβολή RNase για να αποφευχθεί η αποικοδόμηση του RNA, όπως:
1.Σύνθεση του πρώτου κλώνου cDNA, RT-PCR, RT-qPCR, κ.λπ.
2.Προστατεύει το RNA από την αποικοδόμηση κατά τη in vitro μεταγραφή/μετάφραση (π.χ. in vitro σύστημα αντιγραφής ιών).
3.Αναστολή της δραστηριότητας RNase κατά τον διαχωρισμό και τον καθαρισμό RNA.
Συνθήκες αποθήκευσης
Το προϊόν μπορεί να αποθηκευτεί στους -25 ~ 15 ℃, με ισχύ για 2 χρόνια.
Αποθηκευτικός χώρος αποθήκευσης
50 mM KCl, 20 mM HEPES-KOH (ρΗ 7,6, 25 ℃), 8 mM DTT και 50% γλυκερίνη.
Ορισμός μονάδας
Η ποσότητα του αναστολέα RNase ποντικού που απαιτείται για την αναστολή της δραστηριότητας 5 ng ριβονουκλεάσης Α κατά 50% ορίστηκε ως μία μονάδα (U).
Μοριακό βάρος πρωτεΐνης
Το μοριακό βάρος του αναστολέα RNase ποντικού είναι 50 kDa.
Ελεγχος ποιότητας
Εξωνουκλεάση Δραστηριότητα:
40 U αναστολέα RNase ποντικού με 1 μg λ-Hind III DNA πέψης στους 37℃ για 16 ώρες δεν αποδίδει αποικοδόμηση όπως προσδιορίζεται με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης.
Δραστηριότητα ενδονουκλεάσης:
40 U αναστολέα RNase ποντικού με 1μg λ DNA στους 37℃ για 16 ώρες δεν αποδίδει αποικοδόμηση όπως προσδιορίζεται με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης.
Nicking Δραστηριότητα:
40 U αναστολέα RNase ποντικού με 1μg pBR322 στους 37℃ για 16 ώρες δεν αποδίδουν αποικοδόμηση όπως προσδιορίζεται με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης.
RNase Δραστηριότητα:
40 U αναστολέα RNase ποντικού με 1,6μg MS2 RNA για 4 ώρες στους 37℃ δεν αποδίδει αποικοδόμηση όπως προσδιορίζεται με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης.
E.coli DNA:
40 U αναστολέα RNase ποντικού ελέγχονται για την παρουσία γονιδιωματικού DNA του Ε. coli χρησιμοποιώντας TaqMan qPCR με εκκινητές ειδικούς για τον τόπο του Ε. coli 16S rRNA.Η μόλυνση του γονιδιωματικού DNA του E. coli είναι ≤ 0,1 pg/40 U.
Nότεs
1. Η βίαιη ταλάντωση ή ανάδευση θα οδηγήσει σε αδρανοποίηση του ενζύμου.
2. Το βέλτιστο εύρος θερμοκρασίας αυτού του αναστολέα ήταν 25-55 ℃, και απενεργοποιήθηκε στους 65 ℃ και άνω.
3. Οι δραστηριότητες της RNase H, RNase 1 και RNase T1 δεν αναστέλλονται από τον αναστολέα RNase ποντικού.
4. Η αναστολή της δραστηριότητας RNase βρέθηκε σε ένα ευρύ φάσμα pH (το pH 5-9 ήταν όλα ενεργά) και η υψηλότερη δραστηριότητα παρατηρήθηκε σε pH 7-8.
5. Δεδομένου ότι οι ριβονουκλεάσες τυπικά διατηρούν τη δράση υπό συνθήκες μετουσίωσης, πρέπει να ληφθεί μέριμνα ώστε να αποφευχθεί η μετουσίωση των μορίων του αναστολέα της RNase που έχουν συμπλοκοποιηθεί με μια ριβονουκλεάση.Για να αποφευχθεί η απελευθέρωση ενεργού ριβονουκλεάσης, θα πρέπει να αποφεύγονται θερμοκρασίες μεγαλύτερες από 50 °C και υψηλές συγκεντρώσεις ουρίας ή άλλων μετουσιωτικών παραγόντων.
