Πρωτεϊνάση K NGS (σκόνη)

Προσδιορισμός

Ιδιότητες

Ορισμός μονάδας

Μία μονάδα NGS Πρωτεάσης Κ ορίζεται ως η ποσότητα ενζύμου που απαιτείται για την υδρόλυση της καζεΐνης σε 1 μmol L-τυροσίνης υπό τυπικές συνθήκες προσδιορισμού.

 Προετοιμασία αντιδραστηρίων

Αντιδραστήριο Ι:

Υπόστρωμα: 1% Καζεΐνη από διάλυμα βοείου γάλακτος: διαλύστε 1 g καζεΐνης βοείου γάλακτος σε 50 ml διαλύματος φωσφορικού νατρίου 0,1 M, pH 8,0, θερμάνετε σε υδατόλουτρο στους 65-70 °C για 15 λεπτά, ανακατέψτε και διαλύστε, ψύξτε με νερό, ρυθμισμένο με υδροξείδιο του νατρίου σε pH 8,0 και αραιώστε σε 100 ml.

Αντιδραστήριο II:

Διάλυμα TCA: 0,1 Μ τριχλωροξικό οξύ, 0,2 Μ οξικό νάτριο και 0,3 Μ οξικό οξύ (ζυγίστε 1,64 g τριχλωροξικό οξύ + 1,64 g οξικό νάτριο + 1,724 ml οξικό οξύ διαδοχικά, προσθέστε 50 mL απιονισμένο νερό, ρυθμίστε το pH 4 σε HCl0. 100 ml).

Αντιδραστήριο III:

Διάλυμα ανθρακικού νατρίου 0,4 m (ζυγίστε 4,24 g άνυδρου ανθρακικού νατρίου και διαλύστε σε 100 mL νερό)

Αντιδραστήριο IV:

Αντιδραστήριο φολίνης φαινόλης: αραιώστε 5 φορές με απιονισμένο νερό.

Αντιδραστήριο V:

Αραιωτικό ενζύμου: 0,1 Μ διάλυμα φωσφορικού νατρίου, pH 8,0.

Αντιδραστήριο VI:

Πρότυπο διάλυμα L-τυροσίνης: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml L-τυροσίνη διαλυμένη με 0,2Μ HCl.

Διαδικασία

1. Ενεργοποιήστε το φασματοφωτόμετρο UV-Vis και επιλέξτε φωτομετρική μέτρηση.

2. Ορίστε το μήκος κύματος στα 660 nm.

3. Ενεργοποιήστε το λουτρό νερού, ρυθμίστε τη θερμοκρασία στους 37℃, βεβαιωθείτε ότι η θερμοκρασία παραμένει αμετάβλητη για 3-5 λεπτά.

4. Προθερμάνετε 0,5 mL υποστρώματος σε σωλήνα φυγοκέντρησης 2 mL σε υδατόλουτρο 37℃ για 10 λεπτά.

5. Εκχυλίστε 0,5 mL αραιωμένου διαλύματος ενζύμου στον προθερμασμένο σωλήνα φυγοκέντρησης για 10 λεπτά.Ορίστε το αραιωτικό ενζύμου ως τυφλή ομάδα.

6. Προσθέστε 1,0 mL αντιδραστηρίου TCA αμέσως μετά την αντίδραση.Ανακατέψτε καλά και επωάστε σε υδατόλουτρο για 30 λεπτά.