M-MLV Αντίστροφη Μεταγραφάση
RevScript Η ανάστροφη μεταγραφάση λαμβάνεται με τεχνολογία γενετικής μηχανικής.Έχει υψηλότερη ικανότητα σύνθεσης cDNA, θερμική σταθερότητα και όριο θερμοκρασίας αντίδρασης (έως 60°C).Το συντιθέμενο προϊόν cDNA είναι έως 10 kb.Ενισχύει τη συγγένεια των προτύπων και είναι κατάλληλο για αντίστροφη μεταγραφή προτύπων RNA με σύνθετη δευτερογενή δομή ή γονίδια χαμηλού αντιγράφου.
Συστατικά
| Συστατικό | HC2003Β (10.000 U) | HC2003Β (5*10.000U) | HC2003Β (200.000 U) |
| RevScript Reverse Transcriptase (200U/μL) | 50 μL | 5×50 μL | 1 mL |
| 5 × RevScript Buffer | 250 μL | 1,25 mL | 5 mL |
Κατάσταση Αποθήκευσης
Αυτό το προϊόν πρέπει να φυλάσσεται στους -25°C~-15°C για 2 χρόνια.
Ορισμός μονάδας
Μία μονάδα ενσωματώνει 1 nmol dTTP σε αδιάλυτο σε οξύ υλικό σε 10 λεπτά στους 37°C χρησιμοποιώντας Oligo(dT) ως εκκινητές.
Ρύθμιση αντίδρασης
1.Μετουσίωση του προτύπου RNA (Αυτό το βήμα είναι προαιρετικό, η μετουσίωση του προτύπου RNA βοηθά στο άνοιγμα των δευτερογενών δομών, γεγονός που θα βελτιώσει την απόδοση του cDNA του πρώτου κλώνου.)
| Συστατικά | Ενταση ΗΧΟΥ (μL) |
| Χωρίς RNase ddH2O | Μέχρι 13 |
| Oligo(dT)18 (50 μmol/L) ή Random Primer (50 μmol/L) Ή Γονιδιακά Ειδικά Primers (2 μmol/L) | 1 |
| ή 1 | |
| ή 1 | |
| Πρότυπο RNA | X a |
Σημειώσεις:
1) α: Ολικό RNA: 1-5 ug ή mRNA: 1-500 ng
2) Επώαση στους 65°C για 5 λεπτά, στη συνέχεια μεταφορά σε πάγο αμέσως για να κρυώσει για 2 λεπτά.Σύντομη φυγοκέντρηση για τη συλλογή του υγρού της αντίδρασης, προσθέστε το διάλυμα αντίδρασης αντίστροφης μεταγραφής όπως φαίνεται στον ακόλουθο πίνακα.Ανακατέψτε απαλά με σιφώνιο για ανάμειξη.
1.Παρασκευή του μείγματος αντίδρασης (όγκος 20 μL)
| Συστατικά | Ενταση ΗΧΟΥ (μL) |
| Μείγμα προηγούμενου βήματος | 13 |
| 5× Buffer | 4 |
| Μίγμα dNTP (10nmol/L) | 1 |
| Αντίστροφη μεταγραφάση (200 U/μL) | 1 |
| Αναστολέας RNase (40 U/μL) | 1 |
1.Εκτελέστε την αντίδραση υπό τις ακόλουθες συνθήκες:
| Θερμοκρασία (°C) | χρόνος |
| 25 °Ca | 5 λεπτά |
| 42 °Cb | 15-30 λεπτά |
| 85 °Cc | 5 λεπτά |
Σημειώσεις:
1) α.Η επώαση στους 25°C για 5 λεπτά απαιτείται μόνο για τη χρήση των τυχαίων εξαμερών.Παραλείψτε αυτό το βήμα όταν χρησιμοποιείτε Oligo (dT)18ή Gene Specific Primer.
2) β.Η συνιστώμενη θερμοκρασία αντίστροφης μεταγραφής είναι 42°C. Για πρότυπα με περίπλοκες δευτερεύουσες δομές ή υψηλή περιεκτικότητα σε GC, συνιστάται η αύξηση της θερμοκρασίας της αντίδρασης στους 50-55°C.
3) γ.Θέρμανση στους 85°C για 5 λεπτά για να απενεργοποιηθεί η ανάστροφη μεταγραφάση.
4) Το προϊόν μπορεί να χρησιμοποιηθεί απευθείας σε αντιδράσεις PCR ή qPCR ή να αποθηκευτεί στους -20°C για βραχυπρόθεσμη αποθήκευση.Συνιστάται η αναδίπλωση των προϊόντων και η αποθήκευση στους -80°C για μακροχρόνια αποθήκευση.Αποφύγετε τη συχνή κατάψυξη-απόψυξη.
5) Το προϊόν είναι κατάλληλο για RT-qPCR ενός σταδίου, συνιστάται η προσθήκη 10-20 U ανάστροφης μεταγραφάσης για κάθε σύστημα αντίδρασης 25 μL ή η σταδιακή αύξηση της ποσότητας της αντίστροφης μεταγραφάσης ανάλογα με την πραγματική κατάσταση.
Σημειώσεις
1.Παρακαλούμε διατηρήστε την περιοχή του πειράματος καθαρή.Κατά τη λειτουργία πρέπει να φοράτε καθαρά γάντια και μάσκες.Όλα τα αναλώσιμα που χρησιμοποιούνται στο πείραμα θα πρέπει να είναι απαλλαγμένα από RNase για να αποφευχθεί η μόλυνση από RNase.
2.Όλες οι διαδικασίες πρέπει να εκτελούνται σε πάγο για να αποφευχθεί η αποικοδόμηση του RNA.
3.Συνιστώνται δείγματα RNA υψηλής ποιότητας για να διασφαλιστεί η υψηλή αποτελεσματικότητα της αντίστροφης μεταγραφής.
4.Αυτό το προϊόν προορίζεται μόνο για ερευνητική χρήση.
5.Παρακαλούμε να χειρίζεστε με παλτό εργαστηρίου και γάντια μιας χρήσης, για την ασφάλειά σας.
