Ανάστροφη μεταγραφάση M-MLV Neoscript
Η Neoscript Reverse Transcriptase είναι μια αντίστροφη μεταγραφάση που λαμβάνεται με διαλογή μετάλλαξης του γονιδίου M-MLV του ιού της λευχαιμίας ποντικού Moloney προέλευσης και έκφρασης σε E.coli.Το ένζυμο αφαιρεί τη δραστηριότητα της RNase H, έχει υψηλότερη ανοχή στη θερμοκρασία και είναι κατάλληλο για αντίστροφη μεταγραφή σε υψηλή θερμοκρασία.Ως εκ τούτου, είναι χρήσιμο για την εξάλειψη των δυσμενών επιδράσεων της δομής υψηλού επιπέδου του RNA και των μη ειδικών παραγόντων στη σύνθεση του cDNA και έχει υψηλότερη σταθερότητα και ικανότητα σύνθεσης αντίστροφης μεταγραφής.Το ένζυμο έχει υψηλότερη σταθερότητα και ικανότητα σύνθεσης αντίστροφης μεταγραφής.
Συστατικά
1.200 U/μL Neoscript Reverse Transcriptase
2.5 × Ενδιάμεση μνήμη πρώτου κλώνου (προαιρετικό)
* 5 × Το ρυθμιστικό διάλυμα πρώτου κλώνου δεν περιέχει dNTP, προσθέστε dNTP κατά την προετοιμασία του συστήματος αντίδρασης
Προτεινόμενη Εφαρμογή
1.QRT-PCR ενός βήματος.
2.Ανίχνευση ιού RNA.
Κατάσταση Αποθήκευσης
-20°C για μακροχρόνια αποθήκευση, πρέπει να αναμειγνύεται καλά πριν από τη χρήση, να αποφεύγεται η συχνή κατάψυξη-απόψυξη.
Ορισμός μονάδας
Μία μονάδα ενσωματώνει 1 nmol dTTP σε 10 λεπτά στους 37°C χρησιμοποιώντας poly(A)•oligo(dT)25ως πρότυπο / αστάρι.
Ελεγχος ποιότητας
1.SDS-PAGE ηλεκτροφορητική καθαρότητα μεγαλύτερη από 98%.
2.Ευαισθησία ενίσχυσης, έλεγχος batch-to-batch, σταθερότητα.
3.Καμία εξωγενής δραστηριότητα νουκλεάσης, καμία εξωγενής ενδονουκλεάση ή μόλυνση από εξωνουκλεάση
Reaction Setup for First Chain Reaction Solution
1.Παρασκευή του μίγματος αντίδρασης
| Συστατικά | Ενταση ΗΧΟΥ |
| Oligo(dT)12-18 Αλφαβητάρι ή Random Primerένα Ή Gene Specific Primersb | 50 pmol |
| 50 pmol (20-100 pmol) | |
| 2 pmol | |
| 10 mM dNTP | 1 μL |
| Πρότυπο RNA | Ολικό RNA≤ 5μg;mRNA≤ 1 μg |
| dH χωρίς RNase2O | Σε 10 μL |
Σημειώσεις:α/β: Επιλέξτε διαφορετικούς τύπους ασταριών σύμφωνα με τις πειραματικές σας ανάγκες.
2.Ζεσταίνουμε στους 65°C για 5 λεπτά και κρυώνουμε γρήγορα σε πάγο για 2 λεπτά.
3.Προσθέστε τα ακόλουθα συστατικά στο παραπάνω σύστημα σε συνολικό όγκο 20 μL και ανακατέψτε απαλά:
| Συστατικά | Ενταση ΗΧΟΥ (μL) |
| 5 × Ρυθμιστικό διάλυμα πρώτης δέσμης | 4 |
| Neoscript Reverse Transcriptase (200 U/μL) | 1 |
| Αναστολέας RNase (40 U/μL) | 1 |
| dH χωρίς RNase2O | Έως 20 μL |
4. Εκτελέστε την αντίδραση σύμφωνα με τις ακόλουθες συνθήκες:
(1) Εάν χρησιμοποιείται Random Primer, η αντίδραση πρέπει να διεξάγεται στους 25℃ για 10 λεπτά και στη συνέχεια στους 50℃ για 30~60 λεπτά.
(2) Εάν χρησιμοποιούνται Oligo dT ή ειδικοί εκκινητές, η αντίδραση πρέπει να διεξαχθεί στους 50℃ για 30~60 λεπτά.
5.Θερμάνετε στους 95℃ για 5 λεπτά για να απενεργοποιήσετε την αντίστροφη μεταγραφάση Neoscript και να τερματίσετε την αντίδραση.
6.Τα προϊόντα αντίστροφης μεταγραφής μπορούν να χρησιμοποιηθούν απευθείας στην αντίδραση PCR και την ποσοτική αντίδραση PCR φθορισμού ή να αποθηκευτούν στους -20℃ για μεγάλο χρονικό διάστημα.
PCR Rδράση:
1.Παρασκευή του μίγματος αντίδρασης
| Συστατικά | Συγκέντρωση |
| 10 × Ρυθμιστικό διάλυμα PCR (χωρίς dNTP, χωρίς Mg²+) | 1× |
| dNTP (10 mM κάθε dNTP) | 200 μΜ |
| 25 mM MgCl2 | 1-4 mM |
| Taq DNA Polymerase (5U/μL) | 2-2,5 U |
| Primer 1 (10 μM) | 0,2-1 μΜ |
| Primer 2 (10 μM) | 0,2-1 μΜ |
| Πρότυποένα | ≤10% Διάλυμα Πρώτης Αλυσιδωτής Αντίδρασης (2 μL) |
| ddH2O | Έως 50 μL |
Σημειώσεις:α: Εάν προστεθεί πάρα πολύ διάλυμα πρώτης αλυσιδωτής αντίδρασης, η αντίδραση PCR μπορεί να ανασταλεί.
2.Διαδικασία αντίδρασης PCR
| Βήμα | Θερμοκρασία | χρόνος | Κύκλοι |
| Προ-μετουσίωσης | 95℃ | 2-5 λεπτά | 1 |
| Μετουσίωσης | 95℃ | 10-20 δευτ | 30-40 |
| Ανόπτηση | 50-60℃ | 10-30 δευτ | |
| Επέκταση | 72℃ | 10-60 δευτ |
Σημειώσεις
1.Κατάλληλο για βελτιστοποίηση θερμοκρασίας αντίστροφης μεταγραφής στην περιοχή 42℃~55℃.
2.Έχει καλύτερη σταθερότητα, είναι κατάλληλο για ενίσχυση αντίστροφης μεταγραφής σε υψηλή θερμοκρασία.Επιπλέον, είναι ευνοϊκό για την αποτελεσματική διέλευση μέσω πολύπλοκων δομικών περιοχών του RNA.Επίσης, αυτόείναι κατάλληλο για ποσοτική ανίχνευση RT-PCR πολλαπλού φθορισμού ενός σταδίου.
3.Καλή συμβατότητα με διάφορα ένζυμα ενίσχυσης PCR και είναι κατάλληλο για αντιδράσεις RT-PCR υψηλής ευαισθησίας.
4.Κατάλληλο για υψηλής ευαισθησίας ποσοτική αντίδραση RT-PCR φθορισμού ενός σταδίου, βελτιώνει αποτελεσματικά τον ρυθμό ανίχνευσης χαμηλής συγκέντρωσης προτύπων.
5.Κατάλληλο για κατασκευή βιβλιοθήκης cDNA.
