Ένζυμο κάλυψης του ιού δαμαλίτιδας

Το ένζυμο κάλυψης του ιού δαμαλίτιδας προέρχεται από ένα ανασυνδυασμένο στέλεχος Ε. coli που φέρει τα γονίδια για το ένζυμο κάλυψης δαμαλίτιδας.Αυτό το μεμονωμένο ένζυμο αποτελείται από δύο υπομονάδες (D1 και D12) και έχει τρεις ενζυμικές δραστηριότητες (RNA τριφωσφατάση και γουανυλυλοτρανσφεράση από την υπομονάδα D1 και μεθυλοτρανσφεράση γουανίνης από την υπομονάδα D12).Το ένζυμο κάλυψης του ιού δαμαλίτιδας είναι αποτελεσματικό για να καταλύει το σχηματισμό της δομής καλύμματος, το οποίο μπορεί να προσαρτήσει ειδικά τη δομή καλύμματος 7-μεθυλγουανυλικού (m7Gppp, Cap 0) στο 5' άκρο του RNA.Η δομή του καλύμματος (Cap 0) παίζει σημαντικό ρόλο στη σταθεροποίηση, τη μεταφορά και τη μετάφραση του mRNA στους ευκαρυώτες.Η κάλυψη του RNA με ενζυματική αντίδραση είναι μια αποτελεσματική και απλή μέθοδος που μπορεί να βελτιώσει σημαντικά τη σταθερότητα και τη μετάφραση του RNA για in vitro μεταγραφή, επιμόλυνση και μικροέγχυση.

Συστατικά

Ένζυμο κάλυψης του ιού δαμαλίτιδας (10 U/μL)

10×Προσθήκη κάλυψης

Συνθήκες αποθήκευσης

-25～- 15℃ για αποθήκευση (Αποφύγετε επαναλαμβανόμενους κύκλους κατάψυξης-απόψυξης)

Αποθηκευτικός χώρος αποθήκευσης

20 mM Tris-HCl (ρΗ 8,0), 100 mM NaCl,

1 mM DTT, 0. 1 mM EDTA, 0. 1% Triton X- 100, 50% γλυκερίνη.

Ορισμός μονάδας

Μία μονάδα ενζύμου κάλυψης ιού δαμαλίτιδας ορίζεται ως η ποσότητα ενζύμου που απαιτείται για την ενσωμάτωση 10 pmol GTP σε ένα αντίγραφο 80nt σε 1 ώρα στους 37°C.

Ελεγχος ποιότητας

Εξωνουκλεάση:10 U ενζύμου κάλυψης του ιού δαμαλίτιδας με 1μg DNA χώνευσης λ-Hind III στους 37 ℃ για 16 ώρες δεν αποδίδουν αποικοδόμηση όπως προσδιορίζεται με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης.

Ενδονουκλεάση:10 U ενζύμου κάλυψης ιού δαμαλίτιδας με 1μg λDNA στους 37℃ για 16 ώρες δεν αποδίδουν αποικοδόμηση όπως προσδιορίζεται με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης.

Nickase:10 U ενζύμου κάλυψης του ιού δαμαλίτιδας με 1 μg pBR322 στους 37 ℃ για 16 ώρες δεν αποδίδουν αποικοδόμηση όπως προσδιορίζεται με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης.

RNase:10 U ενζύμου κάλυψης ιού δαμαλίτιδας με 1,6 μg MS2 RNA για 4 ώρες στους 37 ℃ δεν αποδίδουν αποικοδόμηση όπως προσδιορίζεται με ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης.

1.coli DNA:10 U ενζύμου κάλυψης ιού δαμαλίτιδας ελέγχονται για την παρουσία γονιδιωματικού DNA του E. coli χρησιμοποιώντας TaqMan qPCR με εκκινητές ειδικούς για τον τόπο rRNA του Ε. coli 16S.Η μόλυνση του γονιδιωματικού DNA του E. coli είναι γονιδίωμα ≤1 E. coli.

2.Βακτηριακός Ενδοτοξίνη: Δοκιμή LAL, σύμφωνα με την έκδοση Κινέζικης Φαρμακοποιίας IV 2020, μέθοδος δοκιμής ορίου γέλης, γενικός κανόνας (1143).Η περιεκτικότητα σε βακτηριακή ενδοτοξίνη πρέπει να είναι ≤10 EU/mg.

Σύστημα και συνθήκες αντίδρασης

1. Πρωτόκολλο κάλυψης (όγκος αντίδρασης: 20 μL)

Αυτή η διαδικασία εφαρμόζεται στην αντίδραση κάλυψης 10μg RNA (≥100 nt) και μπορεί να κλιμακωθεί ανάλογα με τις πειραματικές απαιτήσεις.

I) Συνδυάστε 10μg RNA και H2O χωρίς νουκλεάση σε σωληνάριο μικροφυγοκέντρου 1,5 ml σε τελικό όγκο 15,0 μL.*10×Ρυθμιστικό διάλυμα κάλυψης: 0,5M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH 8,0)

2) Θερμάνετε στους 65℃ για 5 λεπτά ακολουθούμενο από παγόλουτρο για 5 λεπτά.

3) Προσθέστε τα ακόλουθα στοιχεία με τη σειρά που καθορίζεται

*10×Ρυθμιστικό διάλυμα κάλυψης: 0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH8,0)

4) Επωάστε στους 37°C για 30 λεπτά, το RNA είναι πλέον καλυμμένο και έτοιμο για κατάντη εφαρμογές.

2. Τερματικό 5′ αντίδραση επισήμανσης (όγκος αντίδρασης: 20 μL)

Αυτό το πρωτόκολλο έχει σχεδιαστεί για την επισήμανση RNA που περιέχει ένα τριφωσφορικό 5' και μπορεί να κλιμακωθεί ανάλογα με τις απαιτήσεις.Η αποτελεσματικότητα της ενσωμάτωσης της ετικέτας θα επηρεαστεί από τη μοριακή αναλογία RNA: GTP, καθώς και από την περιεκτικότητα σε GTP σε δείγματα RNA.

1) Συνδυάστε κατάλληλη ποσότητα RNA και H2O χωρίς νουκλεάση σε σωληνάριο μικροφυγοκέντρου 1,5 ml σε τελικό όγκο 14,0 µL.

2) Θερμάνετε στους 65℃ για 5 λεπτά ακολουθούμενο από παγόλουτρο για 5 λεπτά.

3) Προσθέστε τα ακόλουθα στοιχεία με τη σειρά που καθορίζεται.

** Το GTP MIX αναφέρεται σε GTP και σε μικρό αριθμό δεικτών.Για τη συγκέντρωση του GTP, ανατρέξτεστη Σημείωση 3.

4) Επωάστε στους 37°C για 30 λεπτά.

Εφαρμογές

1. Κάλυψη mRNA πριν από προσδιορισμούς μετάφρασης/μετάφραση in vitro

2. Επισήμανση 5' άκρου mRNA

Σημειώσεις για τη χρήση

1.Η θέρμανση του διαλύματος του RNA πριν από την επώαση με το ένζυμο κάλυψης Vaccinia αφαιρεί τη δευτερογενή δομή στο 5' άκρο του μεταγράφου.Επεκτείνετε το χρόνο σε 60 λεπτά για μεταγραφές με γνωστά εξαιρετικά δομημένα 5'άκρα.

2. Το RNA που χρησιμοποιείται για τις αντιδράσεις κάλυψης θα πρέπει να καθαρίζεται πριν από τη χρήση και να εναιωρείται σε νερό χωρίς νουκλεάση.Δεν πρέπει να υπάρχει EDTA και το διάλυμα πρέπει να είναι απαλλαγμένο από άλατα.

3. Για την επισήμανση του άκρου 5', η συνολική συγκέντρωση GTP θα πρέπει να είναι περίπου 1-3 φορές τη μοριακή συγκέντρωση του mRNA στην αντίδραση.

4. Ο όγκος του συστήματος αντίδρασης μπορεί να αυξηθεί ή να μειωθεί ανάλογα με την πραγματική.