PNGase F
Η πεπτιδική-Ν-γλυκοσιδάση F(PNGase F) είναι η πιο αποτελεσματική ενζυμική μέθοδος για την αφαίρεση σχεδόν όλων των Ν-συνδεδεμένων ολιγοσακχαριτών από τις γλυκοπρωτεΐνες.Η PNGase F είναι μια αμιδάση, η οποία διασπά μεταξύ των εσωτερικών περισσότερων υπολειμμάτων GlcNAc και ασπαραγίνης με υψηλή περιεκτικότητα σε μαννόζη, υβριδικούς και σύνθετους ολιγοσακχαρίτες από Ν-συνδεδεμένες γλυκοπρωτεΐνες.
Εφαρμογή
Αυτό το ένζυμο είναι χρήσιμο για την απομάκρυνση των υπολειμμάτων υδατανθράκων από τις πρωτεΐνες.
Προετοιμασία και προδιαγραφές
| Εμφάνιση | Άχρωμο Υγρό |
| Καθαρότητα πρωτεΐνης | ≥95% (από SDS-PAGE) |
| Δραστηριότητα | ≥500.000 U/mL |
| Εξωγλυκοσιδάση | Δεν ήταν δυνατή η ανίχνευση δραστηριότητας (ND) |
| Ενδογλυκοσιδάση F1 | ND |
| Ενδογλυκοσιδάση F2 | ND |
| Ενδογλυκοσιδάση F3 | ND |
| Ενδογλυκοσιδάση Η | ND |
| Πρωτεάση | ND |
Ιδιότητες
| Αριθμός ΕΚ | 3.5.1.52(Ανασυνδυασμένο από μικροοργανισμό) |
| Μοριακό βάρος | 35 kDa (SDS-PAGE) |
| Ισοηλεκτρικό σημείο | 8. 14 |
| Βέλτιστο pH | 7,0-8,0 |
| Βέλτιστη θερμοκρασία | 65 °C |
| Ειδικότητα υποστρώματος | Διάσπαση γλυκοσιδικών δεσμών μεταξύ υπολειμμάτων GlcNAc και ασπαραγίνης Εικ. 1 |
| Τοποθεσίες αναγνώρισης | Ν-συνδεδεμένες γλυκάνες εκτός εάν περιέχουν α1-3 φουκόζη Εικ. 2 |
| Ενεργοποιητές | DTT |
| Ανασταλτικός παράγοντας | SDS |
| Θερμοκρασία αποθήκευσης | -25 ~ -15 ℃ |
| Απενεργοποίηση θερμότητας | Ένα μείγμα αντίδρασης 20 μL που περιέχει 1 μL PNGase F απενεργοποιείται με επώαση στους 75 °C για 10 λεπτά. |
Εικ. 1 Ειδικότητα υποστρώματος της PNGase F
Εικ. 2 Θέσεις αναγνώρισης της PNGase F.
Όταν τα εσωτερικά υπολείμματα GlcNAc συνδέονται με α1-3 φουκόζη, η PNGase F δεν μπορεί να διασπάσει Ν-συνδεδεμένους ολιγοσακχαρίτες από γλυκοπρωτεΐνες.Αυτή η τροποποίηση είναι κοινή στα φυτά και σε ορισμένες γλυκοπρωτεΐνες εντόμων.
Cεξαρτήματα
|
| Συστατικά | Συγκέντρωση |
| 1 | PNGase F | 50 μl |
| 2 | 10×Ρυθμιστικό διάλυμα μετουσίωσης γλυκοπρωτεΐνης | 1000 μl |
| 3 | 10×GlycoBuffer 2 | 1000 μl |
| 4 | 10% NP-40 | 1000 μl |
Ορισμός μονάδας
Μία μονάδα(U) ορίζεται ως η ποσότητα ενζύμου που απαιτείται για την απομάκρυνση >95% του υδατάνθρακα από 10 μg μετουσιωμένης RNase B σε 1 ώρα στους 37°C σε συνολικό όγκο αντίδρασης 10 μL.
Συνθήκες αντίδρασης
1.Διαλύστε 1-20 μg γλυκοπρωτεΐνης με απιονισμένο νερό, προσθέστε 1 μl ρυθμιστικού διαλύματος μετουσίωσης 10×γλυκοπρωτεΐνης και H2O (αν χρειάζεται) για να σχηματιστεί ένας συνολικός όγκος αντίδρασης 10 μl.
2.Επωάστε στους 100°C για 10 λεπτά, ψύξτε το σε πάγο.
3.Προσθέστε 2 µl 10×GlycoBuffer 2, 2 µl 10% NP-40 και ανακατέψτε.
4.Προσθέστε 1-2 µl PNGase F και H2O (εάν είναι απαραίτητο) για να σχηματιστεί ένας συνολικός όγκος αντίδρασης 20 μl και αναμείξτε.
5.Επωάστε την αντίδραση στους 37°C για 60 λεπτά.
6.Για ανάλυση SDS-PAGE ή ανάλυση HPLC.
