mRNA Cap2'-O-Μεθυλοτρανσφεράση

Το mRNA Cap 2' -O-methyltransferase προήλθε από ένα ανασυνδυασμένο στέλεχος E. coli που φέρει το γονίδιο για το mRNA Cap 2 '-O-Methyltransferase της δαμαλίτιδας.Αυτό το ένζυμο προσθέτει μια ομάδα μεθυλίου στη θέση 2'-O του πρώτου νουκλεοτιδίου δίπλα στη δομή του καπακιού στο 5' άκρο του RNA. Το ένζυμο χρησιμοποιεί S-αδενοσυλομεθειονίνη (SAM) ως δότη μεθυλίου για να μεθυλιώσει το καλυμμένο RNA (cap -0) με αποτέλεσμα μια δομή καπ- 1.

Η δομή Cap1 μπορεί να αυξήσει την αποτελεσματικότητα της μετάφρασης, βελτιώνοντας την έκφραση του mRNA σε πειράματα μορφομετατροπής και μικροέγχυσης. Αυτό το ένζυμο απαιτεί ειδικά RNA με κάλυμμα m7GpppN ως υπόστρωμα.Δεν μπορεί να χρησιμοποιήσει RNA με pN, ppN, pppN ή GpppN στο άκρο 5΄.Το καλυμμένο RNA μπορεί να παρασκευαστεί μέσω μεταγραφής in vitro με χρήση αναλόγου καλύμματος ή μέσω ενζυματικής κάλυψης χρησιμοποιώντας το ένζυμο κάλυψης Vaccinia.

Συστατικά

mRNA Cap 2´-O-Methyltransferase (50U/μL)

10×Κεφάλαιο Reaction Buffer

Αποθήκευση

-25 ～- 15 ℃ για αποθήκευση (Αποφύγετε τους επαναλαμβανόμενους κύκλους κατάψυξης-απόψυξης)

Αποθηκευτικός χώρος αποθήκευσης

20 mM Tris-HCl (pH 8,0, 25℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0, 1 mM EDTA, 0, 1% Triton X-100, 50% γλυκερίνη.

Ορισμός μονάδας

Μία μονάδα ορίζεται ως η ποσότητα του ενζύμου που απαιτείται για τη μεθυλίωση 10 pmole μεταγραφής RNA με κάλυψη 80 nt σε 1 ώρα στους 37°C.

Αναλύσεις ποιοτικού ελέγχου

Εξωνουκλεάση:50 U mRNA Cap 2' -O-Methyltransferase με 1μg DNA πέψεως λ-Hind III στους 37 ℃ για 16 ώρες δεν αποδίδει αποικοδόμηση όπως προσδιορίζεται με ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης.

Ενδονουκλεάση: 50 U mRNA Cap 2´ -O-Methyltransferase με 1 μg λDNA στους 37℃ για 16 ώρες δεν αποδίδουν αποικοδόμηση όπως προσδιορίζεται με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης.

Nickase: 50 U mRNA Cap 2' -O-Methyltransferase με 1 μg pBR322 στους 37 ℃ για 16 ώρες δεν αποδίδουν αποικοδόμηση όπως προσδιορίζεται με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης.

RNase: 50 U mRNA Cap 2' -O-Methyltransferase με 1,6μg MS2 RNA για 4 ώρες στους 37℃ δεν αποδίδουν αποικοδόμηση όπως προσδιορίζεται με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης.

E. coli DNA: 50 U mRNA Cap 2´ -O-Methyltransferase εξετάζονται για την παρουσίαE. coli γονιδιωματικό DNA χρησιμοποιώντας TaqMan qPCR με εκκινητές ειδικούς για τηνE. coli Τόπος 16S rRNA.οE. coli Η μόλυνση του γονιδιωματικού DNA είναι =1E. coli γονιδίωμα.

Βακτηριακός Ενδοτοξίνη: Δοκιμή LAL, σύμφωνα με την έκδοση Κινέζικης Φαρμακοποιίας IV 2020, μέθοδος δοκιμής ορίου γέλης, γενικός κανόνας (1143).Η περιεκτικότητα σε βακτηριακή ενδοτοξίνη πρέπει να είναι =10 EU/mg.

Σύστημα και συνθήκες αντίδρασης

1. Συνδυάστε μια κατάλληλη ποσότητα Capped RNA και H2O χωρίς RNase σε ένα σωλήνα μικροφυγοκέντρησης 1,5 mL σε τελικό όγκο 16,0 µL.

2. Θερμάνετε στους 65℃ για 5 λεπτά ακολουθούμενο από παγόλουτρο για 5 λεπτά.

3. Προσθέστε τα ακόλουθα συστατικά με τη σειρά που καθορίζεται (για μεθυλίωση του Capped RNA

λιγότερο από 10

*10× Ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης κάλυψης: 500 mM Tris-HCl (pH 8,0, 25℃), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT.

4. Επωάστε στους 37℃ για 1 ώρα (συνιστώνται 2 ώρες επώασης για το θραύσμα στόχο μικρότερο από 200 nt).

Εφαρμογές

Για τη βελτίωση της έκφρασης mRNA κατά τη διάρκεια πειραμάτων μικροέγχυσης και επιμόλυνσης.

Σημειώσεις για τη χρήση

1. Πριν από την αντίδραση, το RNA πρέπει να καθαριστεί και να διαλυθεί σε νερό χωρίς νουκλεάση, όλα τα διαλύματα δεν πρέπει να περιέχουν καθόλου EDTA και ιόντα.

2. Συνιστάται η θέρμανση του δείγματος RNA στους 65℃ για 5 λεπτά πριν από την αντίδραση για να αφαιρεθεί η δευτερεύουσα δομή στο 5' άκρο του μεταγραφήματος.Θα μπορούσε να επεκταθεί σε 10 λεπτά για σύνθετη 5΄-τερματική δομή.