ΚΙΤ ELISA δίκλωνου RNA (dsRNA).

Αυτό το κιτ είναι μια σύζευξη ανοσοπροσροφητικής δοκιμασίας με ένζυμο (ELISA) με σύστημα βιοτίνης-στρεπταβιδίνης, για ποσοτική μέτρηση του dsRNA με μήκος πάνω από 60 ζεύγη βάσεων (bp), ανεξάρτητα από την αλληλουχία.Η πλάκα έχει προεπικαλυφθεί με αντίσωμα αντι-dsRNA.Το dsRNA που υπάρχει στο δείγμα προστίθεται και συνδέεται με αντισώματα επικαλυμμένα στα φρεάτια.Και στη συνέχεια προστίθεται βιοτινυλιωμένο αντίσωμα αντι-dsRNA και δεσμεύεται στο dsRNA στο δείγμα.Μετά το πλύσιμο, προστίθεται HRP-Streptavidin και συνδέεται με το Βιοτινυλιωμένο αντίσωμα αντι-dsRNA.Μετά την επώαση, η μη δεσμευμένη HRP-Streptavidin απομακρύνεται με έκπλυση.Στη συνέχεια προστίθεται διάλυμα υποστρώματος TMB και καταλύεται με HRP για να παραχθεί ένα προϊόν μπλε χρώματος που άλλαξε σε κίτρινο μετά την προσθήκη όξινου διαλύματος τερματισμού.Η πυκνότητα του κίτρινου είναι ανάλογη με την ποσότητα στόχου του dsRNA που συλλαμβάνεται στο τρυβλίο.Η απορρόφηση μετράται στα 450 nm.

Εφαρμογή

Αυτό το κιτ προορίζεται για ποσοτική μέτρηση του υπολειπόμενου dsRNA.

Εξαρτήματα κιτ

Αποθήκευση και σταθερότητα

1. Για αχρησιμοποίητο κιτ: Ολόκληρο το κιτ θα μπορούσε να αποθηκευτεί στους 2~8℃ στη διάρκεια ζωής.Το δυνατό φως πρέπει να αποφεύγεται για σταθερότητα αποθήκευσης.

2. Για μεταχειρισμένο κιτ: Μόλις ανοίξει η μικροπλάκα, καλύψτε τα αχρησιμοποίητα φρεάτια με σφραγιστικό πλάκας και επιστρέψτε στη θήκη αλουμινίου που περιέχει τη συσκευασία ξηραντικού, κλείστε τη θήκη με φερμουάρ και επιστρέψτε στους 2~8℃ το συντομότερο δυνατό μετά τη χρήση.Άλλα αντιδραστήρια θα πρέπει να επιστραφούν στους 2~8℃ το συντομότερο δυνατό μετά τη χρήση.

Υλικά που απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται

1. Συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών με φίλτρο 450±10 nm (καλύτερα αν μπορεί να ανιχνευθεί σε μήκος κύματος 450 και 650 nm).

2. Αναδευτήρας μικροπλάκας.

3. Ρύγχη χωρίς RNase και σωλήνες φυγοκέντρησης.

Διάγραμμα ροής λειτουργίας

Πριν ξεκινήσεις

1. Φέρτε όλα τα εξαρτήματα και τα δείγματα του κιτ σε θερμοκρασία δωματίου (18-25℃) πριν από τη χρήση.Εάν το κιτ δεν θα χρησιμοποιηθεί σε μία φορά, αφαιρέστε μόνο ταινίες και αντιδραστήρια για το παρόν πείραμα και αφήστε τις υπόλοιπες ταινίες και αντιδραστήρια στην απαιτούμενη κατάσταση.

2. Ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης: αραιώστε 40 mL ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης 20× με 760 ml απιονισμένου ή απεσταγμένου νερού για να παρασκευάσετε 800 ml ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης 1×.

3. Πρότυπο: περιστρέψτε για λίγο ή φυγοκεντρήστε το αρχικό διάλυμα πριν από τη χρήση.Η συγκέντρωση τεσσάρων προτύπων που παρέχονται είναι 5ng/μL.Για τα πρότυπα UTP και pUTP dsRNA, αραιώστε το μητρικό διάλυμα σε 1,0,5,0,25,0,125,0,0625,0,0312,0,0156,0 pg/μL με ρυθμιστικό διάλυμα STE για να σχεδιάσετε την τυπική καμπύλη.Για πρότυπα N1-Me-pUTP dsRNA, αραιώστε το μητρικό διάλυμα σε 2,1,0,5,0,25,0,125,0,0625,0,0312, 0 pg/μL με ρυθμιστικό διάλυμα STE για να σχεδιάσετε την τυπική καμπύλη.Για το πρότυπο dsRNA 5-OMe-UTP, αραιώστε το μητρικό διάλυμα σε 4,2,1,0,5, 0,25,0,125,0,0625, 0 pg/μL με ρυθμιστικό διάλυμα STE για να σχεδιάσετε την τυπική καμπύλη.Συνιστούμε τα πρότυπα να μπορούν να αραιωθούν ως τα ακόλουθα διαγράμματα:

4. Βιοτινυλιωμένο αντίσωμα ανίχνευσης και διάλυμα εργασίας HRP-στρεπταβιδίνης: περιστρέψτε ή φυγοκεντρήστε σύντομα το αρχικό διάλυμα πριν από τη χρήση.Αραιώστε τα μέχρι τη συγκέντρωση εργασίας με ρυθμιστικό διάλυμα αραίωσης.

5. Υποκατάσταση TMB: αναρροφήστε την απαιτούμενη δόση του διαλύματος με αποστειρωμένα άκρα και μην πετάξετε ξανά το υπολειμματικό διάλυμα στο φιαλίδιο.Το υπόστρωμα TMB είναι ευαίσθητο στο φως, μην εκθέτετε το υπόστρωμα TMB στο φως για μεγάλο χρονικό διάστημα.

Χρήση πρωτοκόλλου

1. Προσδιορίστε τον αριθμό των ταινιών που απαιτούνται για τον προσδιορισμό.Τοποθετήστε τις λωρίδες στα πλαίσια για χρήση.Οι υπόλοιπες λωρίδες πλάκας που δεν χρησιμοποιούνται σε αυτή τη δοκιμασία θα πρέπει να επανασυσκευάζονται στη σακούλα με ξηραντικό.Κλείστε καλά τη σακούλα για αποθήκευση στο ψυγείο.

2. Προσθέστε 100μL καθεμία από τις αραιώσεις προτύπου, τυφλού και δειγμάτων στα κατάλληλα βυθίσματα.Καλύψτε με το στεγανοποιητικό πιάτου.Επωάστε για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με ανακίνηση στις 500 rpm.Τα δείγματα θα πρέπει να αραιωθούν με ρυθμιστικό διάλυμα STE σε κατάλληλη συγκέντρωση για ακριβή προσδιορισμό.

3. Βήμα πλύσης: Αναρροφήστε το διάλυμα και πλύνετε με 250μL ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης σε κάθε φρεάτιο και αφήστε το να σταθεί για 30 δευτερόλεπτα.Απορρίψτε τελείως το ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης κουμπώνοντας το πιάτο σε απορροφητικό χαρτί.Πλύνετε πλήρως 4 φορές.

4. Προσθέστε 100 μL βιοτινυλιωμένου διαλύματος εργασίας αντισώματος ανίχνευσης σε κάθε φρεάτιο.Καλύψτε με το στεγανοποιητικό πιάτου.Επωάστε για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με ανακίνηση στις 500 rpm.

5. Επαναλάβετε το βήμα πλύσης.

6. Προσθέστε 100 μL διαλύματος εργασίας HRP-στρεπταβιδίνης σε κάθε φρεάτιο.Καλύψτε με το στεγανοποιητικό πιάτου.Επωάστε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου με ανακίνηση στις 500 rpm.

7. Επαναλάβετε ξανά το βήμα πλύσης.

8. Προσθέστε 100μL διαλύματος υποστρώματος TMB σε κάθε φρεάτιο.Καλύψτε με το στεγανοποιητικό πιάτου.Επωάστε για 30 λεπτά σε RT Προστατέψτε από το φως.Το υγρό θα γίνει μπλε με την προσθήκη διαλύματος υποστρώματος.

9. Προσθέστε 50μL διαλύματος τερματισμού σε κάθε φρεάτιο.Το υγρό θα γίνει κίτρινο με την προσθήκη διαλύματος τερματισμού.Στη συνέχεια, ενεργοποιήστε τη συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών και πραγματοποιήστε τη μέτρηση στα 450 nm αμέσως.

Υπολογισμός Αποτελεσμάτων

1. Υπολογίστε τον μέσο όρο των διπλών μετρήσεων για κάθε πρότυπο, μάρτυρα και δείγμα και αφαιρέστε τη μέση μηδενική τυπική οπτική πυκνότητα.Κατασκευάστε μια τυπική καμπύλη με απορρόφηση στον κατακόρυφο άξονα (Y) και συγκέντρωση dsRNA στον οριζόντιο (X) άξονα.

2. Συνιστάται η εκτέλεση του υπολογισμού με λογισμικό προσαρμογής καμπυλών που βασίζεται σε υπολογιστή, όπως το curve expert 1.3 ή το ELISA Calc σε μοντέλο μη γραμμικής προσαρμογής 5 ή 4 παραμέτρων.

Εκτέλεση

1. Ευαισθησία:

κατώτερο όριο ανίχνευσης: ≤ 0,001 pg/μL (για UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0,01 pg/μL (για 5-OMe-UTP-dsRNA).

κατώτερο όριο ποσοτικοποίησης: 0,0156 pg/μL (για UTP-, pUTP-dsRNA), 0,0312 pg/μL (για N1-Me-pUTP-dsRNA), 0,0625 pg/μL (για 5-OMe-UTP-dsRNA).

2. Ακρίβεια: CV της ενδοδοκιμασίας ≤10%, βιογραφικό της ενδοδοκιμασίας ≤10%

3. Ανάκτηση:80%~120%

4.Γραμμικότητα:0,0156-0,5pg/μL(forUTP-,pUTP-dsRNA)0,0312-1pg/μL(για N1-Me-pUTP dsRNA),0,0625-1pg/μL(για 5-OMe-UTP-dsRNA).

Θεωρήσεις

1. Η θερμοκρασία και ο χρόνος αντίδρασης TMB είναι κρίσιμοι, παρακαλούμε ελέγξτε τα σύμφωνα με τις οδηγίες αυστηρά.

2. Προκειμένου να επιτευχθεί καλή αναπαραγωγιμότητα και ευαισθησία της ανάλυσης, είναι απαραίτητο το σωστό πλύσιμο των πλακών για την απομάκρυνση της περίσσειας των αντιδραστηρίων που δεν αντέδρασαν.

3. Όλα τα αντιδραστήρια θα πρέπει να αναμιγνύονται καλά πριν από τη χρήση και να αποφεύγονται οι φυσαλίδες κατά την προσθήκη δείγματος ή αντιδραστηρίων.

4. Εάν έχουν σχηματιστεί κρύσταλλοι στο συμπυκνωμένο ρυθμιστικό πλύσης (20x), θερμάνετε στους 37℃ και ανακατέψτε απαλά μέχρι να διαλυθούν τελείως οι κρύσταλλοι.

5. Αποφύγετε τον προσδιορισμό δειγμάτων που περιέχουν Αζίδιο του Νατρίου (NaN3), καθώς θα μπορούσε να καταστρέψει τη δραστηριότητα του HRP με αποτέλεσμα την υποεκτίμηση της ποσότητας του dsRNA.

6. Αποφύγετε τη μόλυνση με RNase κατά τη διάρκεια της ανάλυσης.

7. Το πρότυπο/δείγμα, το αντίσωμα ανίχνευσης και το SA-HRP μπορούν επίσης να διεξαχθούν σε RT χωρίς ανακίνηση, αλλά αυτό μπορεί να προκαλέσει μείωση της ευαισθησίας ανίχνευσης κατά μία φορά.Για αυτήν την περίπτωση, συνιστούμε τα πρότυπα dsRNA UTP και pUTP να αραιώνονται από 2 pg/μL, τα πρότυπα N1-Me-pUTP dsRNA να αραιώνονται από 4 pg/μL και το πρότυπο dsRNA 5-OMe-UTP να αραιώνεται από 8 pg/μL.Επιπλέον, επωάστε το διάλυμα εργασίας HRP-στρεπταβιδίνης για 60 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου.Μη χρησιμοποιείτε αναδευτήρα φιάλης, γιατί ο αναδευτήρας φιάλης μπορεί να οδηγήσει σε ανακριβές αποτέλεσμα.

Τυπικό αποτέλεσμα

1. Δεδομένα τυπικής καμπύλης

2. Υπολογισμός τυπικής καμπύλης

3. Εύρος ανίχνευσης επένδυσης:0,0312- 1pg/μL